文献类型： 中文期刊
作者： 王瑞睿 1 ; 马克异 1 ;
作者机构： 1.上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室;上海海洋大学水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心;中国水产科学研究院东海水产研究所
关键词： 罗氏沼虾;Doublesex;原核表达;蛋白免疫印迹;重组蛋白;透析复性;质谱分析
期刊名称： 广东农业科学
ISSN： 1004-874X
年卷期： 2023 年 50 卷 007 期
页码： 156-163
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： [目的]Doublesex属于DMRT基因家族成员之一,在控制性别特异性分化中起关键作用.克隆罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)Doublesex基因(MrDsx)的开放阅读框序列,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取罗氏沼虾重组蛋白MrDsx,可为后续开展罗氏沼虾MrDsx基因的功能研究提供基础数据.[方法]基于罗氏沼虾MrDsx的开放阅读框序列,通过特异PCR产物与表达载体pET-32a(+)连接,获得重组质粒pET-32a-MrDsx,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建罗氏沼虾MrDsx基因的原核表达细胞.利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对阳性转化细胞进行诱导表达,并以SDS-PAGE电泳,Western blot和质谱分析检测诱导表达的重组蛋白.[结果]以罗氏沼虾性腺cDNA为模板,利用MrDsx基因的特异引物,PCR扩增获得了约660 bp大小的单一 DNA条带.经测序确认为MrDsx基因的ORF序列.重组质粒pET-32a-MrDsx转化后的感受态细胞经IPTG在37℃条件下诱导4 h后获得罗氏沼虾重组蛋白MrDsx.当IPTG终浓度为0.1~0.5 mmol/L时,重组蛋白MrDsx的表达量可达到峰值.可溶性分析显示,重组蛋白MrDsx主要以包涵体形式表达,经8 mol/L尿素溶解、Ni柱纯化及透析复性后,SDS-PAGE电泳和Western blot检测发现重组蛋白的相对分子量约55kD,且条带单一,表明重组蛋白MrDsx能被鼠抗His-tag单克隆抗体特异性识别.质谱分析结果显示,片段化肽段与理论的氨基酸序列相符,匹配度达到100%.[结论]成功获得了 MrDsx基因原核表达的重组质粒pET-32a-MrDsx.诱导表达的重组蛋白经溶解、纯化及复性后,可形成高纯度的活性罗氏沼虾MrDsx重组蛋白,为后续开展罗氏沼虾MrDsx基因的功能研究、互作蛋白的筛选和性别调控机制的解析提供初步依据.
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