文献类型： 中文期刊

作者： 李聪慧 ¹ ; 徐进 ² ; 刘文枝 ² ; 周勇 ² ; 曾令兵 ¹ ;

作者机构： 1.上海海洋大学水产与生命学院

2.中国水产科学研究院长江水产研究所

关键词： 锦鲤疱疹病毒;交叉引物;等温扩增;核酸试纸条;检测

期刊名称： 水产学报

ISSN： 1000-0615

年卷期： 2015 年 39 卷 09 期

页码： 1422-1431

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为建立一种操作简单、结果准确可靠、结果判定直观、成本低廉的现场快速检测方法,为锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)疾病的防控提供技术支撑,根据KHV保守的DNA聚合酶(DNA polymerase,Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(single cross priming amplification,SCPA)进行扩增,优化反应体系的引物浓度组合、Mg2+浓度、d NTPs浓度、反应温度和时间,并结合核酸试纸条技术(nucleic acid test strip detection method),建立了快速可视化检测锦鲤疱疹病毒的单交叉引物等温扩增检测方法(KHV-SCPA)。结果表明,最佳引物浓度组合为引物2a1s1.0μmol/L,2a(2a-Bio)和3a(3a-FIT)各0.5μmol/L,4s和5a各0.6μmol/L,M g2+浓度为8.0 mmol/L,d NTPs浓度为1.2 mmol/L,反应温度63℃,时间60 min。本实验扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带,可特异性地检测出KHV,灵敏度较常规PCR方法提高约1 000倍。带有探针的反应产物采用核酸试纸条检测,在3~5 min内即可通过条带出现与否对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中,为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。