文献类型： 中文期刊

作者： 曹峰子 ¹ ; 伍诚意 ² ; 宋勤叶 ¹ ; 江洪 ³ ; 梁之昶 ⁴ ; 季海峰 ⁵ ; 陈小玲 ⁵ ;

作者机构： 1.河北农业大学

2.江西生物科技职业学院

3.北京泰格瑞分子检验有限公司

4.北京华大吉比爱生物技术有限公司

5.北京市农林科学院

关键词： 反向斑点杂交;rRNA基因;猪致病基因;反向PCR

期刊名称： 生物技术通讯

ISSN： 1009-0002

年卷期： 2010 年 21 卷 03 期

页码： 401-405

摘要： 目的:建立检测猪常见致病菌的反向斑点杂交方法。方法:将23S rRNA基因芯片用的针对12种细菌的25～30 mer探针加长到30～38 mer,2对通用引物序列不变。用地高辛标记下游引物,以尼龙膜为载体制备膜芯片,检验探针/膜杂交的特异性和敏感性;另外设计1条大肠杆菌K88基因探针、一段带K88探针的报告基因和1对报告基因的反向PCR引物,在PCR体系中增加封口的K88报告基因和反向引物对,被检样品扩增后进行膜杂交。结果:修改的13条探针与参考目标菌株在膜上成特异性杂交,对52个参考菌株和野外分离株的检测准确率为92%;膜杂交的敏感性与玻片芯片接近,最小检出量为100 fg DNA;在尼龙膜上增加K88探针,与3重PCR产物杂交,可以检测到大肠杆菌K88毒力基因。结论:建立的反向斑点杂交方法简便快速,检测成本低,可用于仪器设备不足的实验室,同时可以加入检测如大肠杆菌K88等致病基因,提高基于保守基因的芯片的诊断能力。