文献类型： 中文期刊

作者： 张婷婷 ¹ ; 柳伟伟 ² ; 高璐 ² ; 李任建 ² ; 付穗业 ² ; 刘晓健 ² ; 李大琪 ² ; 刘卫敏 ² ; 董卿 ² ; 张建珍 ³ ;

作者机构： 1.山西大学应用生物学研究所;山西大学生命科学学院;山西省农业科学院植物保护研究所

2.;山西大学应用生物学研究所;山西大学生命科学学院;山西省农业科学院植物保护研究所

3.;山西大学应用生物学研究所;山西大学生命科学学院;山西省农业科学院植物保护研究所;

关键词： 飞蝗;几丁质酶5-1;抗体制备;表达分析;Western blot

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2018 年 12 期

页码： 2418-2428

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】通过制备飞蝗(Locusta migratoria)几丁质酶5-1(LmCht5-1)的多克隆抗体,建立飞蝗体内LmCht5-1蛋白水平检测方法,分析LmCht5-1在4龄飞蝗的表达特性及组织定位。【方法】采用MEGA软件对LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列进行比对,利用Expression网站对LmCht5-1氨基酸序列进行抗原表位预测分析,获得LmCht5-1抗原结构区域;以飞蝗c DNA为模板,通过PCR扩增LmCht5-1的抗原片段;同时通过酶切连接构建含有鸡血清白蛋白OVA的载体p ET32a-OVA;然后通过酶切连接将LmCht5-1插入到p ET32a-OVA载体构建p ET32a-OVA-LmCht5-1;将p ET32a-OVA-LmCht5-1转入表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达重组蛋白OVA-LmCht5-1;利用Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价;利用Western blot检测抗体特异性。提取4龄飞蝗不同日龄表皮,采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表达模式。对4龄飞蝗注射ds LmCht5-1,检测蛋白水平LmCht5-1表达量,并通过免疫组化方法对LmCht5-1进行定位及功能分析。【结果】通过LmCht5-1和LmCht5-2序列比对和抗原表位预测分析,获得LmCht5-1的471—533AA可作为抗原区域;通过酶切连接分别获得p ET32a-OVA和p ET32a-OVA-LmCht5-1。经诱导表达和纯化后获得重组蛋白OVA-LmCht5-1,分子量为71.34 k D;免疫后制备多克隆抗体OVA-LmCht5-1,ELISA检测效价为1﹕102 400。多克隆抗体OVA-LmCht5-1用于Western blot检测时可特异性识别LmCht5-1,与LmCht5-2蛋白无交叉反应。利用Western blot方法检测4龄若虫各日龄表皮中LmCht5-1蛋白的表达,发现LmCht5-1蛋白随发育日龄其表达量逐渐增加,在蜕皮当天达到峰值,蜕皮后快速降至最低点。对飞蝗若虫N4D2注射ds LmCht5-1,检测到在N4D5时,LmCht5-1的转录水平和蛋白水平均被显著抑制,抑制率分别为70.0%和73.6%。选取注射ds LmCht5-1和ds GFP的4龄飞蝗表皮,进行免疫组化实验显示LmCht5-1定位于表皮细胞和旧表皮中,其功能失活引起旧表皮中几丁质不降解。【结论】获得飞蝗LmCht5-1多克隆抗体可特异性识别LmCht5-1,可用于Western blot和免疫组化检测。明确LmCht5-1在飞蝗4龄若虫蜕皮当天表达最高,定位于表皮细胞和旧表皮中。ds LmCht5-1可减少表皮细胞和旧表皮中LmCht5-1的表达,阻碍旧表皮中几丁质的降解。