文献类型： 中文期刊

作者： 钱建飞 ¹ ;

作者机构： 1.江苏省农业科学院畜牧兽医研究所

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2000 年 S1 期

页码：

收录情况： 北大核心

摘要： 自从Ｗａｔｓｏｎ和Ｃｒｉｃｋ于１９５３年发现ＤＮＡ双螺旋结构以来，分了生物学取得了飞跃性发展。７０年代初在重组ＮＤＡ技术、细胞培养技术以及生物反应技术等深入发展的基础上，形成了以基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等为主要内容的现代生物技术。近１０多年是世界生物技术迅速发展时期，无论在基础研究方面还是应用开发方面，都取得了令人瞩目的成就，生物技术在生命科学的所有领域得到了广泛的应用，促进了相关学科的发展。尤其是近年来利用生物高新技术研制成功了许多动物基因工程疫苗，展示了其广阔的应用前景，将在动物疫病的控制上具有巨大潜力。本文拟就动物基因工程疫苗的特点、研究现状、存在问题及其对策作一简要叙述。１动物基因工程疫苗的特点 目前用于防制人和动物传染病的疫苗，无论是灭活苗、弱毒苗，还是亚单位苗，其研制都是以大量培养致病微生物为基础的，这不仅给疫苗的制造带来了局限性，同时在疫苗的安全性、免疫性能、产量及保存等诸多方面存在缺陷，如病原微生物灭活不彻底，导致强毒散播；致弱的疫苗返强等。近几年发展起来的基因工程技术为研制新的更为有效的疫苗带来了希望，已成为目前生物技术的热点之一。 基因工程疫苗就是用基因工程方法或分子克隆技术分离出病原的保护性抗原基因，将其转入原核或真核系统使其表达出该病原的保护性抗原，制成疫苗；或者将病原的毒力相关基因删除掉或进行突变，使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗或突变苗，基因工程疫苗只含有病原的部分组成，而常规疫苗往往是一个完整的病原体，因此基因工程疫苗的最大优点是安全性好，对致病力强的病原更是如此。与传统疫苗相比，基因工程疫苗还具有以下优点：第一，可以降低生产成本，更廉价更大批地生产。第二，易于区分感染动物和免疫动物，由于基因工程苗中只含有病原的１－２种蛋白成份，或者缺失某一蛋白成份，因此通过检测野毒中含有，而基因工程疫苗中没有的病毒蛋白的抗体可以方便地从免疫动物中区分出野毒感染者。第三，利用活载体可制成多价疫苗，达到一针防多病的目的。 根据基因工程疫苗研制的技术路线和疫苗组成的不同，目前可分为四大类：①基因工程亚单位苗；②基因缺失苗或突变苗；③活载体苗；④ＤＮＡ疫苗。各种基因工程疫苗的性质见表１。２动物基因工程胜自的研究现状２．ｌ基因工程工单位前基因工程亚单位苗是指用基因工程方法构建的在高效表达系统中表达出来的强毒病原体的某种免疫相关抗原。考虑到用作疫苗的效果和成本，这种重组亚单位疫苗不仅要有良好的保护性免疫原性，而且还必须产量高成本低。基因工程亚单位苗大常采用的表达系统为大肠杆菌表达系统。目前比较成功的是预防幼富腹泻的大肠杆菌苗毛（ｎｇ和马）疫苗，国内外均已投产销售。此外，由南农大杜念兴教授主持的动物生长抑素基因工程苗，在大肠杆菌中获高效表达，并能明显促进动物生长，目前正在进行中试。但对于大多数病毒的保护性免疫抗原来说，“需要利用真核细胞表达系统的重组产物作为亚单位疫苗才能在动物激发良好的保护性免疫反应。这是因为在大肠杆菌系统表达的精蛋白不能粮基化，造成免疫原性大大降低。比较理想的表达系统是酵母目表达系统或昆虫细胞表达系统。例如，将能表达新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ蛋白或传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）的 ＶＰＺ、Ｗｉ和流的重组杆状病毒感染昆虫细胞免疫鸡，即可产生抗 ＮＤ或 ＩＢＤ的保护性免疫反应［１·２］；以杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达的牛抱疹病毒糖蛋白Ｄ，其产量可达如叩乡Ｍ，且具有良好的保护性免疫原性。２．２基因缺失访或突变苗当人为地使病毒的某一基因完全缺失或发生突变而使基因产物失去活性，从而该病毒的野毒株毒力减弱，不再引起临床疾病，但仍能感染原宿主并诱发保护性免疫力。该类疫苗中最有代表性的例子是猪伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）糖蛋白Ｅ ＄因（原称９基因）缺失（伊）及胸腺核着酸激酶基因突变失活（Ｗ）株的活疫苗，东和Ｔｈ基因产物的缺失，使野毒ＰＲＶ的致病性显著减弱。其免疫力不仅与常规的弱毒苗相当，而且由于其叨基因的缺失，使其成为一种标记性疫苗。即该疫苗免疫的猪在产生免疫力的同时不产生抗叨抗体，而自然感染的带毒猪具有抗一抗体，有利于鉴别疫苗免疫和自然感染１３」。正是它具有这一特殊的优点，因此欧共体国家为了实施根除伪狂大病的计划，只允许采用这种少基因工程ＰＲｙ活疫苗，而不再允许使用常规的ＰＲＶ活疫苗［４）。然而，到目前为止这类疫苗中其它成功的例子还不多。２．３活载体苗这类疫苗以某种非致病性病毒或细菌（株）为载体来携带并表达其它强致病性病原的与保护性免疫相关的抗原基因。这是用基因工程方法，将一种病原免疫相关基因整合进另一种载体基因组ＤＮＡ的复制非必需片段中构成的重组活载体苗。在被接种的动物体内，特定免疫原基因可随重组载体的复制而适量表达。现阶段研制出来的新的基因工程疫苗大多数鹰于这一类型。２．３．ｌ活载体病毒疫苗：常作为载体的病毒有痘菌病毒、禽疽病毒（ｆＰＶ）、疤疹病毒、腺病毒、反转录病毒等。在实验室条件下应用得比较成功的这类基因工程疫苗有：能表达猪瘟病毒囊膜精蛋白 ＥＩ的重组 ＰＲＶ（Ｔｈ）［５１，能表达鸡新城疫病．毒的血凝素或融合蛋白的重组禽痘病毒［６，’１，能表达禽流感病毒血凝素基因的重组肖痘病毒【８），能表达马立克病病毒（ＭＤＶ）精蛋白 Ｂ抗原的重组尚痘病毒［９１，能表达鸡新城疫病毒羹股精蛋白、Ｉ型ＭＤＶ＄蛋白Ｂ抗原或传染性法氏羹病病毒ＶＦＺ抗原的重组火鸡抱疹病毒（ＨＶＴ）【‘０－“１，能表达狂犬病羹ｑ＄蛋白的重组痘苗病毒等【１３」，能表达狂犬病囊膜糖蛋的重组大疟疾病毒划中。 与前一类基因突变或基因缺失疫苗相比，重组活载体疫苗比较容易构建。当某一动体病毒的转基因载体质粒构建好了，就很容易进一步构建出能表达各种目的基因的重组载体疫苗。但是，目前除能表达狂犬病病毒囊议精蛋白的重组痘苗病毒在野生动物中用于预防狂犬病病毒感染外，其它重组活载体疫苗在被市场接受前可能还有待进一步改进。２．３．２活载体细菌疫苗２．３．２．ｌ沙门氏菌活载体苗：沙门氏菌作为理想的疫苗载体，它能通过消化道将异源抗原带到肠道的淋巴组织，并在其中繁殖，与免疫前体细胞相互作用，从而激发机体的粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫，以它作为疫苗载体不仅可对肠道细胞病原体产生保护性免疫，而且还可对病毒、寄生虫等其它途径感染病原体有作用。Ｎ山呷珊采用此系统成功地表达链球菌的表面抗体和Ｍ抗原。国内韩文瑜等将Ｅ、Ｃｏｌｔ殉。和ＬＴ－Ｂ抗原基因重组质粒转人弱化的猪霍乱沙门氏菌中，从而构建了猪霍乱沙门氏茵一大肠杆菌为。ＬＴ－Ｂ多价基因工程苗，口服和肌肉注射妊娠母猪，血清和乳清中均产生针对沙门氏菌和大肠杆菌的较高水平的抗体［”）。２．３．２．２大肠杆菌活动体疫苗：大肠杆菌具有与沙门氏菌同样的特点，因此也可以作为疫苗活载体。他的呼”’将合成的口蹄疫病毒ＶＰＩ的１０个氨基酸残基的ＤＮＡ序列插入到Ｅ Ｃｏｌｔ．Ｋ－１２株的外胰蛋白基因中，结果融合蛋白表达正常，用口蹄疫病毒单抗证实了完整自体表面的ｍ抗原。苏国宫等【ｌ’１将志贺氏毒素 Ｂ亚单位的 ３个部分基因融合到 ＥＣＯｌｔ．的另外一种外膜蛋白（ｆｏ１ＹＩＤ）基因的１５３和１５４ ＄码子之间，结果证实融合蛋白表达正常，志贺氏毒素保护性抗原表达于细胞表面，动物免疫试验证明可产生较高水平的抗体。２．３．２．３卡介苗活载体疫苗：卡介苗（ＢＣＧ）是一种分枝杆菌，是Ｗ’ＨＯ所推荐的全世界应用足广泛的疫苗，是目前所知最强的免疫性剂之一。美国研究人员把２０种病原抗原包括疟原虫和ＨＩＶ的几种抗原编码基因克隆在热休克蛋白基因启动子之后，导人ＢＣＧ ｇ因组中，单剂量接种小鼠，能同时诱导体液免疫和细胞免疫［１８］。此后，国内外学者对此领域相当重视，目前已成功地建立了三种基因转移系统，可以有效地把ＤＮＡ引人分枝杆菌，随着研究的深人，重组ＢＣＧ多价疫苗不久将会问世。２．４ ＤＮＡ疫苗 ｌｏｐ年，ＷＡｆ等［１９１发现，将外源基因ＤＮＡ直接注人肌纤维细胞中也能表达，并激发相应的免疫反应。这种带有相应启动子的相应免疫抗原基因的质粒ＤＮＡ在用适当方式注人体内特别是肌细胞中时，就称之为ＤＮＡａｔ苗或基因疫苗。试验表明，在以特殊的基因枪将能表达流感病毒衣完蛋白基因的质粒ＤＮＡ导人小伍回部皮内，只要少至１６纳克的ＤＮＡ就足以诱发很高的抗体效价及相应的细胞毒Ｔ细胞反应［ｔｏ］。最近，ｈｏ。等ｔ２１］以狂犬病病毒 ＤＮＡ＄ｔ免疫大和猫，均田发了较强的抗原特异性免疫反应，他们认为ＤＮＡ免疫可能成为开发新型动物疫苗的有用工具。３动物甚因工租疫苗存在间回及对策３．ｌ免疫原性基因工程亚单位苗是一种非传染性，非复制性的免疫保，通常比复制性完带病原体的免疫原性差，需要多次免疫才能得到有效保护。因此，如何提高该类疫苗的免疫原性是研究人员重点需要解决的问题。目前已有不少方法来克服这一缺点，例如：采用真核表达系统（酵母由和昆虫细胞表达系统筹）可以克服原核表达系统中精蛋白基因不能精基化的问题，提高具有中和保护性的精蛋白的免疫原性。此外，开发出了颗粒动体表达系统，如徐文忠等出）在乙肝表面抗原基因３’末端第２２３位氨基囹处嵌入人工合成的编码１４肽动物生长抑众基因，用在组症菌病毒成功地表达了乙肝表面抗原杂合颗粒，动物生长抑素抗原决定康证实暴露于颗粒表面，免疫动物刺激产生动物生长抑众抗体比在大肠杆菌中表达的抗原刺激产生的抗体滴度要高。３．２安全性对于重组活载体苗来说，有些病毒载体具有潜在的致癌性，如他疾病毒可在神经组织产生持续性感染和终生带毒，腺病毒可在淋巴组织产生持续感染等，反转录病毒和乳多空病毒均具有潜在的致癌性。而疲苗病毒由于其 宿主范围广，对人类具有浴在危险性，在人和动物中与天花病毒类似的症菌病毒在长胡应用过程中，是否有可能会产生 对人类有致病性的新病毒等。因此，重组活额体病毒疫苗能否推广应用关键在于对人类或动物的生物安全性，为了提高 重组活载体病毒疫苗的安全性，各国科学家进行了深人的研究，取得了丰硕成果：（ｌ）研制出宿主持异性活载体苗，如食症病毒活部体苗，尚腺病毒活载体苗等；（２）利用现有疫苗开发活载体首：如火鸡抱疾病毒活部体苗，卡介苗活载体首单； （３）研制出非复制性活载体苗：这类会因工程疫苗的构建方法与复制性活动体疫苗相同，但选用的载体病毒不能在免疫接种动物的体内复制，是一种宿主限制性疫苗。不过，特定强毒的免疫原性基因仍能在接种动物体内少量表达，并足以刺激保护性免疫反应。例如以金丝省痘病毒（ＣＰＶ）为载体表达狂犬病毒羹股精蛋白基因的重组病毒疫苗用来预防人和哺乳动物的狂犬病。此外，这种以ＣＰＶ为载体的宿主限制性重组活载体疫苗在整合进狗的大出热病毒、猫白血病病毒马日本脑炎病毒、马流感病毒的相应免疫原基因后，也已在实验室中显示良好的免疫效果。 用哺乳动物限制性的ＣＰＶ ＃代能在哺乳动物复制的痘菌病毒动体，是考虑到痘苗病毒对人类的生物安全性，采用仅能在鸟类而不能在哺乳动物内增殖的ＣＰＶ或ＦＩ，ｖ，就不可能产生对人类有致病性的新病毒。３．３母源抗体干扰对于活载体苗来说，免疫动物之后，就会产生对载体病毒或载体细菌的免疫反应，从而会影响同一种勤体表达的不同艺图的活出体首的应用。为了克服这一问题，可以研制多价疫苗，即在同一表达电体中招人多个抗原基因，构自多价活成体苗，这样，不仅可以克服用原抗体干扰的问题，而且可以达到一针防多病的目的。如将ＮＤＶ精蛋白和其它座贝尚们如马立克氏们（ＭＤ）的免疫原性德因袖人到同一载体今，成将ＮＤＶ的糟蛋白基因扬人到ＩＩＶＴｔ体中，以达到同时防止几种田贝士们之目的。Ｍｍｐ划列首先研制了表达ＮＤＶ精面白的应组火鸡抱疹病毒疫苗，此苗能同时保护免疫鸡抵抗ＮＤｙ和ＭＤ强毒攻击，但其对ＭＤ保护率嫌低，尚待进一步改进。不过，这是将来活琐体苗研究的趋势。３．４重组病毒的表达量目前丞组疫苗中，抗原的表达量不是很高，这可能与表达出体及启动于的选择有关。顺体及启动子的选择对农达量至关且要，高效农达地体如杆状病毒及强启动子如症苗们对晚期启动子等能显著拓出抗原的表达量。此外，启动于与表达基因起始密码子之间的间隔序列对高水平表达也有益尖影响。ｏ目如用切“）用尚进病毒表达ＨＮ＄因起始密码于之间的窗台ＧＣ序列谷换为ＡＴ丰宫的序列时，表达水平有所加强。对杆状们对而盲，外源基因ＡＷ附近的序列对表达量的高低似乎更为孟翼【到。因此在构建五组病毒时，应尽可能地考虑这些影响表达量的因素，以便能获得足商量的表达抗原。４Ｍ回 自刀年代末期开始基因工程疫苗研究以来，巳取得了令人瞩目的成呆，目前猪狂犬病疫苗和预防的官腹泻的致病性大肠杆茵茵毛疫苗巳经投产销售。痘苗地体多价苗和兽用狂犬病等基因工程疫苗巳进行了临床试验，可望不久投放市场销售。近期有希望研制成功的还有牛囊氏血吸虫病、鸡球虫病、鸡传染性法氏囊病、大应热、新城疫、火鸡流感、牛白血病等基因工程疫苗。此外，动物基因工程首不仅可以防病，而且可以改进动物生产性能，如杜念兴好研制成功的生长抑索基因工程苗，以生长抑法作免疫原。使免疫动物的生长抑素水平下降，生长激素释放增多，从而使动物获得显著增重效果。国内正在研制的基因工程去势疫苗，不仅可以改变传统的手术去势方法，而且也可以达到改善言尚品质，提高增重的效果。因此，展区二十一世纪，动物基因工程疫苗的研究必将会取得更加瞩目的成就。 我国动物基因工程疫苗经过“七五”、’‘八五”和’‘九五”前期研究的准备，现在已具备实施见点突破战略的基础，应选择可行性明显、社会经济效益大，产品优于常规疫苗的基因工程苗作为突破口，并以活地体疫苗和基因缺失苗研究为重点，如火鸡痢疾病毒活地体富、肖疽病毒活繁体苗、腺病毒活载体首及抱疾病毒基因缺失苗等。而且应以开发多价活激体苗为方向。通过基因工程方法构建多价疫苗，可以克服现行疫苗的不足而保留其多价商的优点，如呆在此基础上再插人能表达增强免疫力的细胞因子基因，将会成为最理想的新型疫苗，美国和加拿大巳着手进行这方面的研究［Ｘ，２７］，一旦研制成功将会在生产实践中产生巨大的社会经济效益。动物基因工程疫苗研究进展@钱建飞$江苏省农业科学院畜牧兽医研究所!南京210014[1] Mori , et al.,Avi. 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