文献类型： 中文期刊

作者： 曾凡松 ¹ ; 尹合兴 ¹ ; 史文琦 ¹ ; 汪华 ¹ ; 杨立军 ¹ ; 龚双军 ¹ ; 张学江 ¹ ; 向礼波 ¹ ; 喻大昭 ¹ ;

作者机构： 1.湖北省农业科学院植保土肥研究所/农业部华中作物有害生物综合治理重点实验室

关键词： 小麦赤霉病菌;微管蛋白基因;多菌灵;超量表达

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2015 年 48 卷 04 期

页码： 695-704

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】揭示β1-微管蛋白基因(β1-tub)和β2-微管蛋白基因(β2-tub)在赤霉病菌(Gibberella zeae)对多菌灵的抗性过程中所起的作用。【方法】采用PCR克隆测序法测定Js449(EC50=7.911μg·m L-1)、Js462(EC50=6.515μg·m L-1)、Js484(EC50=5.031μg·m L-1)、Js506(EC50=8.455μg·m L-1)和Js519(EC50=6.280μg·m L-1)等5个多菌灵抗性菌株的α-、β1-、β2-、γ-tub序列,并与敏感菌株HG-1(EC50=0.552μg·m L-1)进行比对。采用实时荧光定量PCR(q PCR)测定β1-tub和β2-tub在多菌灵胁迫下的抗性菌株Js506中的相对表达量。构建β1-tub和β2-tub的超量表达载体,分别在HG-1中表达。运用split PCR获得含有潮霉素磷酸转移酶基因和目标基因的融合片段,并对Js506进行原生质体转化,通过同源重组获得β2-tub的敲除体和互补体。对菌株Js506、HG-1及其突变体分别进行多菌灵敏感性测定、菌落生长观察和致病力测定。【结果】基因比对结果表明,5个抗性菌株的α-、β1-、γ-tub基因序列与敏感菌株的一致。对β2-tub序列比对结果表明,Js449、Js462和Js506菌株的第167位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)变为酪氨酸(Tyr)。Js484菌株的第200位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)变为酪氨酸(Tyr)。Js519菌株的第198位氨基酸由谷氨酸(Glu)变为谷氨酰胺(Gln)。5μg·m L-1多菌灵能诱导Js506菌株的β1-tub表达量显著上调(P<0.05)。10μg·m L-1的多菌灵对Js506菌株的β2-tub表达量影响不显著。β1-tub的超量表达使HG-1突变体的EC50增加至2.839μg·m L-1,抗药性显著增强(P<0.05)。β2-tub超量表达突变体的抗性水平与野生型菌株无显著差异。对Js506菌株的β2-tub进行敲除试验,分别获得了2个转化体(△β2tub-Js506-1、△β2tubJs506-2),经潮霉素抗性筛选、PCR和Southern杂交验证,确认2个转化体均不含有β2-tub。与野生型菌株Js506相比,敲除体△β2tub-Js506-1(EC50=0.078μg·m L-1)和△β2tub-Js506-2(EC50=0.072μg·m L-1)对多菌灵均表现为超级敏感,且菌落生长变慢,致病力显著下降(P<0.05)。对△β2tub-Js506-1进行互补转化获得了2个互补体,β2tub-Js506-C1(EC50=7.521μg·m L-1)和β2tub-Js506-C2(EC50=7.243μg·m L-1),2个互补转化体均使敲除体△β2tubJs506-1基本恢复了抗性、菌落生长速率和致病力。【结论】5个赤霉病菌菌株对多菌灵的抗性与β2-tub的第167、198、200位密码子突变有关,与α-、β1-和γ-tub序列的突变无关。β1-tub在多菌灵胁迫下诱导表达,且β1-tub的超量表达能增强赤霉病菌对多菌灵的抗性。β2-tub是小麦赤霉病菌对多菌灵抗性所必需的,β1-tub和β2tub均能影响赤霉病菌对多菌灵的抗性。