文献类型： 中文期刊

作者： 吴思源 ¹ ; 刘璐 ² ; 王琦 ² ; 潘国强 ² ; 刘海洋 ³ ; 马伯军 ¹ ; 苏晓峰 ² ; 程红梅 ² ;

作者机构： 1.浙江师范大学化学与生命科学学院

2.中国农业科学院生物技术研究所

3.新疆农业科学院植物保护研究所

关键词： 大丽轮枝菌;外切葡聚糖酶;基因克隆;毕赤酵母;酶活

期刊名称： 植物病理学报

ISSN： 0412-0914

年卷期： 2022 年 52 卷 005 期

页码： 769-781

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为了探究大丽轮枝菌外切葡聚糖酶VdCBH1(exoglucanase)的酶活与催化机理,本研究在生物信息学分析的基础上,以大丽轮枝菌V991菌株为材料克隆了 VdCBH1基因,进一步构建了 pPIC9-VdCBH1重组质粒并转入毕赤酵母中进行表达,测定了重组VdCBH1蛋白的外切葡聚糖酶活性;将预测的VdCBH1催化残基位点进行突变,随后通过SDS-PAGE分析了重组VdCBH1蛋白及其催化残基位点突变蛋白的表达情况,并检测了 VdCBH1催化残基位点突变前后的酶活变化.结果表明,VdCBH1基因编码区全长1 356 bp,编码451个氨基酸,蛋白理论分子量大小为48.574 kDa,理论等电点为4.29,N端前17个氨基酸为信号肽序列.保守结构域和进化树分析表明,VdCBH1蛋白含有GH7_CBH_EG保守结构域,该结构域是糖基水解酶7家族(Glycosyl hydrolase family 7,GH7)所特有的,与尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)的外切葡聚糖酶蛋白亲缘关系最近.重组VdCBH1蛋白具有典型的外切葡聚糖酶活性,而G1u233催化残基单突变与Glu228、Asp230和G1u233催化残基三突变蛋白的酶活明显下降.这表明催化残基Glu233在外切葡聚糖酶活性中发挥更为重要的作用,Glu228、Asp230则可能在其中起协同作用.本研究为进一步揭示VdCBH1蛋白的催化机制奠定了理论基础.