文献类型： 中文期刊

作者： 张晨俭 ¹ ; 李隐侠 ² ; 丁强 ² ; 刘伟佳 ¹ ; 王慧利 ² ; 何南 ³ ; 吴家顺 ³ ; 曹少先 ¹ ;

作者机构： 1.南京农业大学动物科技学院

2.江苏省农业科学院畜牧研究所

3.山东农业大学动物科技学院

关键词： 山羊胚胎;细胞因子信号传导抑制因子2;CRISPR/Cas9;基因编辑

期刊名称： 畜牧兽医学报

ISSN： 0366-6964

年卷期： 2024 年 55 卷 001 期

页码： 129-141

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础.本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体外检测sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率;在此基础上将屠宰场山羊卵巢分离培养的442个孤雌胚胎进行分组,2个试验组显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物,对照组注射超纯水,以单个囊胚全基因组DNA扩增产物为模板,PCR扩增靶区域并测序鉴定,发生编辑的样本进行T-A克隆测序检测编辑形式;根据在线网站预测,每条sgRNA选择5个错配数最少的潜在脱靶位点进行脱靶检测.结果表明,在SOCS2基因83和96号氨基酸密码子附近区域获得2条sgRNA并成功构建表达载体,体外转录获得高质量sgRNA和Cas9 mRNA;两条sgRNA均可引导Cas9蛋白在体外完全切割靶DNA;SOCS2-sg-83对胚胎的编辑效率为94.1%,160个T-A克隆中有152个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为95.0%,其中81.3%发生了移码突变,9.4%的克隆缺失83号氨基酸密码子,累计90.6%的克隆实现了 SOCS2基因功能性敲除;SOCS2-sg-96对胚胎的编辑效率为50.0%,80个T-A克隆中有70个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为87.5%,移码突变概率为75.0%,5.0%的克隆缺失了 96号氨基酸密码子,累计80.0%的克隆实现了 SOCS2基因功能性敲除.另外,在所有已编辑胚胎中均未发现脱靶.综上,SOCS2-sg-83可实现山羊胚胎SOCS2基因的高效、精准编辑和敲除,为高效制备SOCS2基因敲除山羊,培育快长型肉用山羊奠定了技术基础.