文献类型： 中文期刊

作者： 李静心 ¹ ; 王慧利 ¹ ; 孟春花 ¹ ; 张庆晓 ¹ ; 蒋进 ¹ ; 王婧 ¹ ; 曹少先 ¹ ;

作者机构： 1.江苏省农业科学院畜牧研究所

关键词： 锌指核酸酶;筛选通用载体;绿色荧光蛋白;真核细胞

期刊名称： 畜牧兽医学报

ISSN： 0366-6964

年卷期： 2014 年 45 卷 06 期

页码： 879-884

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 旨在构建基于GFP报告基因的ZFN真核细胞筛选体系,为ZFN的筛选提供一种直观、准确、灵敏的方法。以pEGFP-N1为基础,去除EGFP基因的起始密码子后在多克隆位点上游插入ATG,构建筛选体系的通用载体pEGFP-ATG。将ZFN的靶序列插入到通用载体EGFP基因上游,且使起始密码子和EGFP基因处于不同ORF中,构建筛选载体pEGFP-728。将pEGFP-728转入Hela细胞中,G418筛选Hela-728细胞系,转染ZFN到Hela-728,48h内通过观察荧光判断ZFN是否有效,挑取荧光细胞进行PCR、测序验证靶序列的敲除。测序分析表明,通用载体pEGFP-ATG和含靶序列的筛选载体pEGFP-728序列完全正确;pEGFP-728转入Hela细胞中观察不到绿色荧光,说明靶序列插入后使EGFP发生移框;转染靶序列对应的ZFN到Hela-728中,48h观察到荧光的表达,说明ZFN有效;挑取6个荧光细胞单克隆,PCR、测序表明4个克隆靶序列发生缺失突变。锌指核酸酶真核细胞筛选体系构建成功。相对于其他方法本筛选体系更加准确、直观、灵敏,更适用于动植物等真核细胞的ZFN筛选,同时还可应用于TALEN和CAS9的筛选。