文献类型： 获奖成果

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获奖名称： 科技进步奖

获奖等级： 三等奖

关键词： 脑组织;鉴定;建立;组织细胞;分离鉴定;组织;脑;疹;疱疹病毒;分离;鲫;细胞;细胞系;鲤;病毒

第一完成单位： 中国水产科学研究院长江水产研究所

获奖时间： 2016

摘要： 本项目分别由2013年～2015年度国家大宗淡水鱼类产业技术体系建设专项资金项目（项目编号CARS-46-11）、2013年度中国水产科学研究院基本科研业务费资助项目（项目编号2013A0606）、2014年度中国水产科学研究院基本科研业务费资助项目（项目编号2014A06XK07）资助，由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类病害研究室承担，总经费163万元人民币，起止时间为2013年1月至2015年12月。其中，编号为2013A0606和编号为2014A06XK07的项目已执行完毕并通过验收，项目执行顺利，并超额完成了项目合同任务，取得了良好的成绩。 鲫是我国重要的大宗淡水鱼养殖品种之一，在我国淡水养殖业中具有十分重要的地位，据统计2014年我国养殖鲫产量已达260多万吨。鲫鱼在我国大部分地区都有规模化养殖，如江苏、湖北、江西、安徽、山东、广东、四川、辽宁、湖南、浙江等省。然而自2007年起，在以鲫鱼为主要养殖品种的江苏盐城地区，一种严重危害养殖鲫鱼的新疾病开始悄然发生与传播。调查资料显示，该病最初在江苏省响水县的黄海农场内个别养殖池塘发现，2008年，该病在江苏大丰市王港闸大面积发生，2009年，几乎整个盐城地区的沿海滩涂鲫鱼养殖区都有发生，2010年至2014年该病在我国江苏全省广泛流行。目前，该病在全国鲫鱼主养区中广泛流行，已成为危害鲫鱼健康养殖最重要的病毒病。患病鲫鱼的主要临床症状为体表广泛性充血或出血、鳃丝肿胀充血或出血，濒死患病鲫鱼捞出水面后可见大量血水从鳃盖流出。解剖发现患病鲫鱼主要内脏器官充血严重。该病的致死率最高可达90-100%，给我国鲫鱼养殖产业造成了巨大的经济损失。 2009年 本研究团队对该病进行了深入的调查与研究，随后确认其病原为鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2），疾病名称确定为鲫造血器官坏死症（Crucian carp haematopoietic necrosis）。鲤疱疹病毒Ⅱ型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2），又称为疱疹病毒性造血器官坏死症病毒（Herpesviral haematopoietic necrosis virus，HVHNV）或金鱼造血器官坏死症病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV），与鲤痘疮病毒（Cyprinid herpesvirus 1，又称鲤疱疹病毒I型，CyHV-1）、锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV，又称鲤疱疹病毒III型，CyHV-3）同属异疱疹病毒科（Alloherpesviridae）鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）成员。CyHV-2于1995年首次在日本患病金鱼体内发现，给日本西部养殖金鱼造成了重大经济损失，患病金鱼死亡率高达100%。随后美国、中国、澳大利亚、英国、捷克等国家和地区也相继有了该病暴发的报道。匈牙利首次报道了在养殖的银鲫体内检测到CyHV-2，捷克、意大利也报道了CyHV-2感染养殖鲫鱼并引起大量死亡的病例。2012年Wang等首次报道了我国东部地区池塘养殖异育银鲫感染CyHV-2的病例。随后，北京、武汉、广州等地养殖异育银鲫中也检测到CyHV-2，证实该病毒在我国分布广泛。 然而，目前国内外对CyHV-2病毒的研究非常有限。Jung 和Groff 分别采用电镜观察濒死金鱼稚鱼的鳃和肾等组织超薄切片，证实了感染细胞内CyHV-2病毒粒子的存在。Miyazaki等发现CyHV-2对FHM、EPC和TO-2细胞系敏感，但复制均不超过4代；对EK-1、CHSE-214和RTG-2三种细胞系不敏感。Jeffrey等接种患病金鱼的鳃组织匀浆上清液到单层的锦鲤鳍细胞（Koi-Fin，KF-1），20℃培养10d后，产生特征性细胞病变效应（CPE），但盲传3代后就无CPE。李霞和福田颖穗报道建立的一种金鱼鳍细胞系（goldfish fin，GFF），接种鲤疱疹病毒后出现CPE，并证实建立的细胞系能进行该病毒的连续传代，但随后Gilad等发现在其他实验室用GFF细胞增殖CyHV-2较为困难。缺乏CyHV-2敏感细胞系已成为制约深入研究该病毒的瓶颈之一。为加强鲫造血器官坏死症的有效防控，需尽快开展该病病原的分离、鉴定及疾病诊断方法研究；建立CyHV-2的敏感细胞系，进行CyHV-2的连续扩大培养，开展CyHV-2理化特性的研究，为CyHV-2的深入研究及防治技术提供重要的实验材料。该研究无论是在学术上还是在生产应用上都具有极其重要的作用。 鉴于此，本研究小组申请了中国水产科学研究院基本科研业务费资助项目并获得立项开展研究，旨在开展鲫造血器官坏死症的病原学、流行病学和检测方法的研究，并建立病原敏感细胞系，查明病毒的感染和致病机理，为鲫鱼养殖业健康可持续发展提供科学保障。 1. 鲫脑组织细胞系的建立及其生物学特性分析 2. 鲫造血器官坏死症病原的分离与鉴定 3. 临床症状与组织病理学 4. 超薄切片电镜观察 5. 鲫脑组织细胞系对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感性的研究 6. 透射电子显微镜观察鲤疱疹病毒Ⅱ型在鲫鱼脑细胞内的超微形态发生 7. 鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性 8. 鲤疱疹病毒Ⅱ型主要功能基因的克隆及不同分离株的序列比对分析 9. 鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型后血液生理生化指标分析 10. 鲫造血器官坏死症诊断技术研究 1.首次建立了来源于鲫鱼脑组织且完全支持鲤疱疹病毒Ⅱ型高效复制的敏感细胞系GiCB，通过病毒细胞培养、电子显微镜观察、病毒核酸检测及形态发生过程、原位杂交、免疫组化，完全证实了鲤疱疹病毒Ⅱ型在GiCB上的复制过程； 2. 首次分离鉴定了鲫造血器官坏死症病原—鲤疱疹病毒Ⅱ型； 3. 对鲫造血器官坏死症进行了详细的病理学分析； 4. 鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒的超微形态发生过程、理化及生物学特性分析； 5. 鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型后血液生理生化指标分析； 6. 建立了四种鲤疱疹病毒Ⅱ型检测方法-巢式PCR检测、LAMP检测、微量样本定量检测的TaqMan realtime-PCR检测，双交叉引物等温扩增CPA检测 本项目技术成熟，适用范围广，安全性好。 本研究建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的鲫鱼脑组织细胞系（GiCB），成功从患鲫造血组织坏死症的病鱼组织中分离到了鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒；对鲫造血器官坏死症进行了详细的病理学和血液生理生化分析并建立了四种鲤疱疹病毒Ⅱ型检测方法；利用该病毒敏感的细胞系对病毒开展了扩大培养，开展了其形态学、超微形态发生、理化特性、基因组特性等研究，为鲤疱疹病毒Ⅱ型的深入研究提供了细胞模型，为鲫造血器官坏死症的防控提供了基础的科学依据，具有重要的科学意义。 本项目建立了四种鲤疱疹病毒Ⅱ型检测方法，分别为适用于实验室微量病毒检测的巢式PCR检测方法、适用于现场诊断的LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）检测方法、适用于微量样本定量检测的TaqMan realtime-PCR检测方法，以及双交叉引物等温扩增（cross priming amplification，CPA）检测方法。在项目的执行过程中，利用建立的检测方法，分别在江苏大丰、射阳、盐都、东台及无锡、湖北荆州、武汉等不同鲫鱼养殖区进行了鲤疱疹病毒Ⅱ型检测，共1900个反应，覆盖水面达53050亩，共增加经济效益约3955.5万元。 本项目建立了四种鲤疱疹病毒Ⅱ型检测方法，分别为适用于实验室微量病毒检测的巢式PCR检测方法、适用于现场诊断的LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）检测方法、适用于微量样本定量检测的TaqMan realtime-PCR检测方法，以及双交叉引物等温扩增（cross priming amplification，CPA）检测方法。在项目的执行过程中，利用建立的检测方法，分别在江苏大丰、射阳、盐都、东台及无锡、湖北荆州、武汉等不同鲫鱼养殖区进行了鲤疱疹病毒Ⅱ型检测，共1900个反应，覆盖水面达53050亩，共增加经济效益约3955.5万元。具体如下： （1）在江苏维昌水产加工有限公司使用鲤疱疹病毒Ⅱ 型LAMP检测试剂盒检测，共800个反应，覆盖养殖水面5000亩，该养殖区域鲤疱疹病毒Ⅱ型发病率约40%，死亡率60%，按每亩产量1000公斤计算，损失240公斤/亩；检测后采取积极地预防及治疗措施，损失降低至140公斤/亩，增加经济效益约500万元。 （2）在荆州市水产技术推广中心鲫鱼养殖场，使用鲤疱疹病毒Ⅱ 型LAMP检测试剂盒检测，共500个反应，覆盖养殖水面6000亩，该养殖区域鲤疱疹病毒Ⅱ 型发病率约20%，死亡率50%，按每亩产量1000公斤计算，损失100公斤/亩；检测后采取预防措施，损失降低至约50公斤/亩，增加经济效益约300万元。 （3）在武汉市蔡甸区丁湾村使用鲤疱疹病毒Ⅱ型巢式PCR检测试剂盒检测，共100个反应，覆盖养殖水面50亩，该养殖场鲤疱疹病毒Ⅱ型发病率约30%，死亡率50%，按每亩产量1200公斤计算，损失180公斤/亩；检测后采取预防及治疗措施，损失降低至70公斤/亩，增加经济效益约5.5万元。 （4）通威公司本研究利用建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型检测方法，共检测500个反应，覆盖养殖水面42000亩，检测后采取积极地预防及治疗措施，损失降低至约75公斤/亩，增加经济效益约3150万元，产生了明显的经济效益。此外，由于进行了鲤疱疹病毒Ⅱ型的检测，明确病原，采取积极地预防及治疗措施，显著减少了抗生素等药物的使用量，对于保护水环境安全、保障水产品质量安全以及人类健康，产生了重要的社会效益，推动了鲫鱼养殖产业的健康发展。 总之 本研究成果的应用，不仅可以减少我国鲫鱼养殖过程中鲫造血器官坏死症造成的经济损失，而且有效地减少抗生素等药物的使用量，保护了养殖水域水环境安全，极大地提高了鲫鱼食品安全水平，为鲫鱼养殖业发挥了促进作用，社会效益显著。无