基于CRISPR/Cas9技术构建猪KLF4基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析

文献类型： 中文期刊

第一作者： 董娇

作者： 董娇;陆繁;方晓敏;陈瑜哲;包文斌;王海飞

作者机构：

关键词： 猪;KLF4基因;CRISPR/Cas9技术;细胞活性;细胞周期

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN：

年卷期： 2024 年 003 期

页码： 893-902

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）基因敲除的猪小肠上皮细胞，并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs（sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3）,经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接，产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定，并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）。PCR扩增敲除位点附近序列，并通过测序判断sgRNA敲除效率；利用CruiserTM Enzyme酶切鉴定阳性细胞克隆，通过TA克隆测序鉴定敲除序列；利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示，sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现，3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除，其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经CruiserTM Enzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现，KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明，KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示，敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性（P＜0.01）,并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞，且KLF4基因敲除可抑制细胞活性，并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。

分类号： Q78%S828

  • 相关文献

[1]CRISPR/Cas9技术在猪、鸡中的应用研究进展. 李晓娇,何燕华,朱新宇,邹娴,罗成龙. 2022

[2]不同供体细胞及其处理对猪核移植重构胚体外发育的影响. 张德福,刘东,汤琳琳,王英,陈茵,王凯,王根林,KARL Schellander. 2007

[3]IL-15过表达对猪骨骼肌细胞成肌分化的影响. 邢明杰,顾宪红,王枭鸿,郝月. 2022

[4]体细胞的组织来源及培养代数对猪核移植重构胚发育的影响. 张德福,刘东,汤琳琳,王英,陈茵,王凯,Karl Schellander. 2006

[5]牛Klf4基因重组反转录病毒载体的构建及产毒细胞株的建立. 辛晓玲,吕长荣,陈冬梅,窦忠英. 2010

[6]外源性三碘甲腺原氨酸对鸭胚肝细胞活性及Ⅲ型脱碘酶基因表达的影响. 孙文强,胡艳,李慧芳,陈宽维. 2015

[7]重金属对罗氏沼虾血细胞活性和酯酶活力的影响. 郭慧,张秀霞,郑佩华,鲁耀鹏,冼健安. 2017

[8]中药金银花体外抗牛病毒性腹泻病毒的作用研究. 刘占悝,李智杰,刘泽余,李健友,张淑琴,王超,郭利. 2020

[9]不同LED光质对培养火龙果胚性愈伤组织的影响. 黄文静,杨光柱,刘丹丹,李帆,郑丽萍,马钧. 2022

[10]应用激光共聚焦显微技术检测镉对植物根系生长的影响. 张卫娜,陈中健,吴秀菊,朱翠,李秀梅,梁锐,陈庄. 2016

[11]氨基酸转化三七花中稀有人参皂苷及提取液对脂多糖诱导的RAW264.7细胞活性的影响. 邵紫君,李志满,于鹏程,陈建波,李珊珊,孙印石. 2021

[12]利用CRISPR/Cas9技术敲除拟南芥转录因子MYB40的两种可变剪接体. 李孟湛,尹红菊,李丁丁,刘亚琪,王锁民. 2019

[13]利用CRISPR/Cas9系统构建SBNO2基因敲除细胞系及其功能研究. 王妍鳕,任亭亭,孙跃峰,刘磊. 2021

[14]丝瓜LcPPO1基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建. 陈敏氡,王彬,刘建汀,叶新如,曾美娟,朱海生,温庆放,康玉妹. 2021

[15]基于CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除OsFAD2创制高油酸水稻突变体. 任代胜,刘浩,乔保建. 2021

[16]CRISPR/Cas9技术在大豆抗病虫育种中的应用前景. 徐杰飞,郭泰,王志新,郑伟,李灿东,赵海红,张振宇,郭美玲. 2020

[17]OsYABBY4基因调控水稻株高的功能研究. 董皓,李懿星,王天抗,宋书锋,邱牡丹,李磊,李莉. 2021

[18]利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ifi30基因. 曹顶臣,佟广香,吕伟华,孙志鹏,匡友谊,郑先虎,孙效文. 2016

[19]利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼bco1基因与bco1l基因. 李文龙,冯永永,李凯彬,聂湘平. 2018

[20]猪SCD1和SCD5双基因敲除细胞系的构建及其对脂肪沉积的影响. 方钱海,郭帅,任红艳,白文哲,高斯,刘雯雯,陈洪波,张立苹. 2024

作者其他论文 更多>>

微信小程序