基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对Ⅰ型干扰素转录的影响

文献类型： 中文期刊

第一作者： 黄秋艳

作者： 黄秋艳;杨烨城;张昆丽;孟繁明;李剑豪;朱向星;王塑天;唐冬生

作者机构：

关键词： CRISPR/Cas9;STING基因;猪肺泡巨噬细胞;基因敲除;Ⅰ型干扰素

期刊名称： 南方农业学报

ISSN： 2095-1191

年卷期： 2022 年 04 期

页码： 891-898

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】阐明干扰素基因刺激因子（STING）在猪抗病原微生物感染中的作用机制，为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术，在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列，将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体（STING-sgRNA）；以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞，得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞；经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株，通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果；并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞，均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果，且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒，再用慢病毒感染3D4/21细胞，结果获得1株STING基因大片段（4989 bp）缺失的3D4/21细胞株，Western blotting检测未发现STING蛋白，说明STING基因敲除3D4/21细胞（3D4/21-STING-/-）构建成功。与野生型3D4/21细胞相比，在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下，3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低（P<0.05）。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因，而导致STING基因功能丧失；STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍，也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。

分类号： S852.4`Q78

  • 相关文献

[1]基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对I型干扰素转录的影响. 黄秋艳,杨烨城,张昆丽,孟繁明,李剑豪,朱向星,王塑天,唐冬生. 2022

[2]CRISPR/Cas9基因编辑技术在线虫中的应用进展和展望. 曹绪文,张留所. 2018

[3]利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株. 周燕霞,胡韦维,张虹洋,邹琳,张鹏辉. 2019

[4]弓形虫MORN2基因敲除株的构建及其表型鉴定. 陈凯,王金磊,白梦捷,杨文彬,黄思扬. 2018

[5]弓形虫4个假定蛋白基因缺失株的构建及其基本生物功能学研究. 王沛,王萌,李婷婷,郑晓楠,梁勤立,陈小庆. 2022

[6]利用CRISPR/Cas9技术敲除水稻Pi21基因的效率分析. 范方军,李文奇,朱金燕,王军. 2016

[7]CRISPR/Cas9技术制备猪肌肉生长抑制素基因敲除细胞. 华文君,毕延震,刘西梅,张立苹,肖红卫,郑新民,华再东,任红艳. 2015

[8]发根农杆菌介导的甜瓜CRISPR/Cas9系统靶位点的检测. 朱蕾. 2024

[9]HEK293T细胞敲除TPL2基因促进塞内卡病毒复制的研究. 闫鸣昊,郝军红,张大俊,申超超,徐国伟,侯景,张克山,郑海学,刘湘涛. 2020

[10]弓形虫ROP5与ROP18的双基因缺失株构建及表型鉴定. 陈芸,刘旗,张曼玉,耿小玲,蒋蔚,王权. 2023

[11]CRISPR/Cas9系统敲除山羊CDK2基因载体构建及转染效率检测. 万苗苗,阳倩,陈吉璐,陈丹丹,毛林,班谦,陈胜,惠文巧. 2024

[12]敲除RIG-I基因流感病毒高产MDCK细胞系的建立及功能研究. 曾为俊,许曼,王辉,鲁国涛,邵玉乐,陈洪岩,刘建华,孟庆文. 2019

[13]RALY基因敲除PK-15细胞系的构建及对口蹄疫病毒复制的影响. 张林,吴金恩,任玫,王学飞,李硕,王嘉宁,魏凡华,郭慧琛. 2023

[14]稳定表达CD163蛋白的猪肺泡巨噬细胞系的建立. 赵凯,冯磊,郑其升,侯继波,陈溥言. 2012

[15]PCV2通过NF-κB/NLRP3信号通路调控体外培养PAMs分泌IL-1β. 李海花,张蕾,杨春蕾,赵向华,乔家运,王文杰. 2016

[16]猪SUMO1基因的碱基序列特征及其在猪肺炎支原体感染过程中的表达. 王丽,杨晓阳,曹静,赵为民,涂枫,付言峰,李碧侠,陈哲,任守文,方晓敏. 2020

[17]RNAscope原位杂交技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA方法的建立. 崔蒙蒙,李江南,王刚,何希君,翁长江. 2018

[18]猪圆环病毒2型体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析. 汪伟,王小敏,何孔旺,温立斌,倪艳秀. 2016

[19]在猪肺泡巨噬细胞上Notch信号通路调控LPS诱导的炎性反应研究. 陆艳,杨义,张彦兵,魏建超,刘珂,邵东华,李蓓蓓,马志永,邱亚峰. 2021

[20]猪鼻支原体与猪地方性肺炎. 王占伟,熊琪琰,邵国青. 2012

作者其他论文 更多>>

微信小程序