猪hnRNPK蛋白与酪氨酸蛋白激酶c-Src的互作分析

文献类型： 中文期刊

第一作者： 梁小娟

作者： 梁小娟;徐海霞;李瑞;张朋朋;徐永杰

作者机构：

关键词： 猪;hnRNPK;c-Src;SH3结构域;酵母双杂交;GST-Pull down

期刊名称： 畜牧兽医学报

ISSN： 0366-6964

年卷期： 2018 年 02 期

页码： 243-252

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 旨在探讨猪不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)与含SH3结构域的非受体型酪氨酸激酶(c-Src)之间的互作关系。采用PCR和酶切连接的方法,构建pGBKT7-hnRNPK、pGADT7-c-Src、pGADT7-ΔSH3、pGADT7-ΔSH2、pGADT7-ΔPTKc和pGADT7-SH3酵母双杂交载体,用PEG-LiAc法转化到酵母菌株AH109中,鉴定其自激活活性,并通过酵母双杂交方法从体内验证猪hnRNPK蛋白与c-Src不同缺失体之间的相互作用;采用DNA重组技术构建pET28a-hnRNPK与pGEX-6p1-c-Src、pGEX-6p1-ΔSH3、pGEX-6p1-ΔSH2、pGEX-6p1-ΔPTKc和pGEX-6p1-SH3蛋白表达载体,转化E.coli BL21经IPTG诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化融合蛋白,通过GST pull-down试验从体外验证猪hnRNPK蛋白与c-Src不同缺失体之间的相互作用。结果表明,成功构建了猪hnRNPK与c-Src不同缺失体的酵母双杂交重组质粒,转化酵母细胞发现各质粒均无自激活活性;在酵母中,与阴性对照相比,共转化pGBKT7-hnRNPK与pGADT7-c-Src或pGADT7-ΔPTKc或pGADT7-SH3的酵母菌落在SDTrp-Leu-His-Ade四缺培养基上生长良好,表明在酵母中hnRNPK与c-Src激酶N端的SH3结构域之间存在直接的相互作用;成功构建了猪hnRNPK与c-Src不同缺失体的融合表达质粒,经IPTG诱导表达及纯化获得了可溶性His-hnRNPK、GST-c-Src、GST-ΔSH3、GST-ΔSH2、GST-ΔPTKc和GST-SH3融合蛋白,GST pull-down试验表明,hnRNPK与c-Src N端存在较强的相互作用,与SH2和PTKc结构域相互作用则较弱。本研究揭示了猪hnRNPK蛋白可与c-Src蛋白的N-端的SH3结构域互作,有助于进一步研究它们的调节位点,为深入探讨hnRNPK与c-Src相互调控关系,进而阐明其生物学功能奠定了基础。

分类号： S828

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