一种基于截短N蛋白的猪丁型冠状病毒抗体ELISA检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

第一作者： 王东升

作者： 王东升;于瑞明;张莉萍;白英杰;刘霞;王永录;杜晓华;刘新生

作者机构：

关键词： 猪δ冠状病毒;截短N蛋白;IgG抗体;间接ELISA

期刊名称： 生物工程学报

ISSN： 1000-3061

年卷期： 2025 年 41 卷 007 期

页码： 2760-2773

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为了建立一种猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)抗体检测方法,将PDCoV CH/XJYN/2016毒株N基因序列插入原核表达质粒载体pColdⅡ中,表达重组蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2,经SDS-PAGE分析和Ni+-NTA纯化后,检测重组原核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)阳性血清的反应原性和特异性.同时对重组真核蛋白PDCoV-N1和PDCoV-N2进行Western blotting和间接免疫荧光实验验证分析.最后使用重组原核蛋白PDCoV-N2建立间接ELISA方法,优化反应条件,检测敏感性、特异性及重复性,并对102份临床血清进行了检测.重组原核蛋白PDCoV-N2与PEDV抗血清交叉反应较低.以PDCoV-N2蛋白制备的间接ELISA方法的最优条件为:抗原包被浓度1.25 μg/mL,37 ℃包被1h,BSA封闭液4 ℃过夜,血清最佳稀释浓度1∶50,37 ℃孵育1h,酶标二抗最佳稀释比例为1∶80 000,37 ℃孵育1 h,加入四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色液37 ℃反应10 min.待检样品的S/P值(样本值-阴性对照值)/(阳性对照值-阴性对照值)≥0.45为阳性,S/P 值≤0.38为阴性,S/P值介于0.45和0.38之间,则为可疑.检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪圆环病毒 2 型(porcine circovirus 2,PCV2)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis of swine,TGEV)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus,ASFV)阳性血清,结果显示,其他冠状病毒的S/P值均小于0.38,表明其具有良好的特异性;PDCoV抗血清800倍稀释后仍为阳性;批间和批内重复性实验结果显示,本方法变异系数均小于10%;临床血清样本检测结果显示,该方法与中和实验的符合率为94.12%.本研究基于截短的PDCoV N蛋白,建立了能够检测抗PDCoV特异性IgG抗体的ELISA方法,且该方法敏感、特异、稳定、重复性好,为PDCoV的临床诊断提供了新的方法.

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