基于外膜蛋白的鼻气管鸟杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

第一作者： 徐浩钧

作者： 徐浩钧;刘颖;梅晨;徐彤;利凯;王宏俊

作者机构：

关键词： 鼻气管鸟杆菌;外膜蛋白;间接ELISA;特异性;灵敏性

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2024 年 51 卷 010 期

页码： 4420-4428

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]建立鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale,ORT)血清抗体的ELISA检测方法.[方法]利用原核表达方法克隆表达鼻气管鸟杆菌外膜蛋白OR02,经Western blotting鉴定其免疫原性.以纯化产物作为抗原包被于固相载体,采用棋盘滴定法确定抗原包被浓度和血清稀释度.同时,优化ELISA反应条件,利用鼻气管鸟杆菌阴性血清确定该检测方法的阴阳临界值判定标准.通过检测其他病原阳性血清评估该方法的特异性,检测不同比例稀释的鼻气管鸟杆菌阳性血清以评估其灵敏性,并与商品化试剂盒进行比较,评估该ELISA方法的符合率.[结果]重组蛋白OR02以包涵体形式表达,分子质量约为58 ku,与预期相符.Western blotting显示,OR02重组蛋白能与鼻气管鸟杆菌阳性血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性.以纯化的OR02蛋白作为包被抗原,确定最佳抗原包被浓度为2 ng/μL,血清样本的稀释度为1∶50,孵育时间为30 min,酶标二抗的稀释度为1∶5 000,孵育时间为30 min,最佳底物显色条件为在避光条件下孵育15 min.阴阳临界值的判定标准为:当待检血清D450nm值≥0.266时判定为阳性,当待检血清D450nm值<0.266时判定为阴性.用该方法检测副鸡禽杆菌(Apg)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)等单因子阳性鸡血清均无交叉反应.将抗体滴度为1∶64的鼻气管鸟杆菌阳性鸡血清以1∶800稀释仍能检测到阳性结果.与商业试剂盒对相同临床样本的检测结果的符合率为91.25%.[结论]本研究利用重组OR02蛋白建立了一种检测鼻气管鸟杆菌血清抗体的间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性和灵敏性,且与商业试剂盒的符合率较高,可作为鸡血清鼻气管鸟杆菌抗体的检测工具.

分类号： S852.61

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