基于鸽鹦鹉热衣原体外膜蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

文献类型： 中文期刊

第一作者： 张紫萱

作者： 张紫萱;杨志远;刘月焕;杨宝琳;高洁;冯倩倩;罗伟珏;林健;赵际成;黄程;胡格

作者机构：

关键词： 鸽;鹦鹉热衣原体;间接ELISA;间接血凝试验(IHA);抗体

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2025 年 52 卷 010 期

页码： 4920-4929

收录情况： 北大核心

摘要： [目的]建立一种适用于鸽鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法.[方法]试验对Cps的主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)编码基因进行密码子优化,在N-端加入触发因子(trigger factor,TF)后连接至pET-30a(+)载体构建重组质粒pET-30a-M,经IPTG诱导表达和纯化后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行可溶性分析及鉴定.通过棋盘滴定法选择最佳抗原包被浓度和血清稀释度,优化鸽Cps抗体的间接ELISA法.比较本研究建立的间接ELISA法与间接血凝试验(indirect hemagglutination assay,IHA)的敏感性.通过检测鸽其他常见疾病阳性血清评估该方法的特异性,检测Cps阳性和阴性血清各3份以评估其重复性,并利用253份鸽源血清(174份临床血清样品、79份Cps灭活疫苗免疫后血清样品)评估该间接ELISA法与 IHA法的符合率.[结果]SDS-PAGE和Western blotting结果显示,在诱导超声破碎后上清中成功表达大小约100 ku的MOMP蛋白,表明该蛋白具有可溶性.间接ELISA法优化后条件为:2 μg/mL抗原4 ℃包被过夜,5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h,血清稀释度为1∶200、血清孵育时间为1 h,辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸽IgY孵育30 min,底物反应时间为10 min.鸽Cps阳性血清稀释度为1∶16时,间接ELISA法检测结果仍为阳性,敏感性高于IHA法.间接ELISA法与其他常见鸽病阳性血清均无交叉反应.批内和批间重复试验结果显示,间接ELISA法变异系数均<10%,表明该方法具有良好的重复性.本研究建立的间接ELISA法和IHA法检测临床样品和免疫后血清样品的符合率分别为80.72%和85.71%,Kappa值分别为0.60和0.69.[结论]本研究建立的间接ELISA法敏感性高、特异性强、重复性好,适用于Cps血清抗体的检测.

分类号： S852.69

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