鸡TIGAR基因真核表达质粒的构建及其抗凋亡功能评价

文献类型： 中文期刊

第一作者： 栗永华

作者： 栗永华;车路平;仇旭升;谭磊;孙英杰;刘炜炜;宋翠萍;廖瑛;丁铲;王金泉;孟春春

作者机构：

关键词： TIGAR;真核表达质粒;新城疫病毒;抗凋亡;鸡

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2019 年 06 期

页码： 1102-1109

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【背景】TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和去除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)并降低由活性氧诱发的细胞凋亡水平。【目的】构建鸡源TIGAR基因的真核表达质粒,并检测TIGAR基因在DF1细胞中的抗凋亡作用,为建立稳定表达鸡TIGAR基因的细胞系做准备。【方法】根据GenBank(登录号:XM_417232.6)中预测基因设计引物,利用RT-PCR的方法从SPF鸡脾脏中扩增鸡TIGAR基因,将扩增产物克隆至载体(Flag-CMV14)后送公司测序验证;随后构建进化树对鸡TIGAR基因与其他哺乳动物及水生动物的TIGAR基因进行同源性分析。将重组质粒(Flag-TIGAR)转染入DF1细胞24 h后,使用新城疫病毒诱导细胞凋亡,利用Western Blot检测重组质粒表达情况以及Poly ADP-Ribose Polymerase(PARP)裂解情况。此外还将重组质粒(Flag-TIGAR)转染入DF1细胞,并于收样前2 h使用Staurosporine刺激细胞发生凋亡,分别在转染后24、48 h收集样品,并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】RT-PCR扩增TIGAR基因,在843 bp处出现目的条带与预测相符,构建的TIGAR真核表达质粒(Flag-TIGAR)经测序,结果显示其序列与GenBank上预测的基本一致。Western Blot结果显示在30 h、36 h收集的样品中PARP均被裂解且转染重组质粒(Flag-TIGAR)的实验组与未转染质粒(MOCK)组或转染空载体(Flag-CMV14)组的样品相比,裂解的PARP表达量明显降低,且差异极显著(P<0.01)。流式结果显示:24 h检测转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为11%(早期凋亡7.8%,晚期凋亡3.2%),而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率仅为4%(早期凋亡3.7%,晚期凋亡0.3%),转染Flag-CMV14的早期凋亡率和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR组,且差异显著(P<0.05)。48 h转染Flag-CMV14后细胞总凋亡率为20.3%(早期凋亡14.3%,晚期凋亡6.0%),而转染Flag-TIGAR后细胞总凋亡率为6.4%(早期凋亡4.8%,晚期凋亡1.6%),转染Flag-CMV14组的细胞早期凋亡和晚期凋亡率均高于转染Flag-TIGAR的组,且差异极显著(P<0.01)。【结论】成功扩增出鸡TIGAR基因,并构建了其真核表达质粒,通过Western Blot和流式实验均证实过表达TIGAR后可降低细胞的凋亡程度并有利于细胞存活。

分类号： S831

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