文献类型： 中文期刊

第一作者： 许占友

作者： 许占友;张爱民;张树榛;贾继增;黎裕

作者机构：

期刊名称： 生物技术

ISSN： 1004-311X

年卷期： 2000 年 10 卷 05 期

页码： 34-38

摘要： ＲＡＰＤ (ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍＤＮＡ ,ＲＡＰＤ)标记是由Ｗｉｌｌｉａｍｓ等于 1 990年提出的 ,一种检测ＤＮＡ多态性的方法 ,由于该方法中所选用引物的碱基是随机的 ,所用引物可达成百上千 ,所检测到的是生物体的整个基因组 ,既能检测有功能的基因编码区 ,又能检测到重复序列区 ,用同一套引物可对多个群体或物种进行分析 ,其所用引物的随机性和其所检测的结果具有更为可靠的统计性和更好的代表性 ,使ＲＡＰＤ标记在重要基因的标记、定位、系统进化、群体多样性和遗传演化等方面得到了广泛的应用。但ＲＡＰＤ标记具有三个主要缺点 ,一是ＲＡＰＤ标记中的一条ＥＢ染色的带往往是一种混合标记 ,是在基因组ＤＮＡ中扩增位点不一 ,长度相同或不同的一组片段的混合片段标记 ;二是ＲＡＰＤ标记在多态性位点的扩增带大多为显性标记 ,因此不能区分个体基因型是纯合还是杂合个体 ;三是该方法的稳定性和重复性较差。解决以上三个问题的方法是将筛选到的ＲＡＰＤ标记进行回收、克隆和纯化 ,将ＲＡＰＤ标记中的混合片段转化为等位特异性ＰＣＲ(ＡＳ -ＰＣＲ)、或序列特异扩增区ＳＣＡＲ标记、或将其中的单拷贝序列转化为ＲＦＬＰ标记的一个探针或ＳＴＳ标记 (ＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇｅｄＳｉｔｅ)。通过以上三种办法 ,即能解决ＲＡＰＤ标记混合标记的问题 ,又能把显性标记转化为共显性的ＡＳ -ＰＣＲ、ＳＣＡＲ、ＲＦＬＰ或ＳＴＳ标记 ,同时这些标记的稳定性和重复性都很高 ,解决了ＲＡＰＤ标记稳定性的问题。把ＲＡＰＤ标记转化为其它分子标记的过程中 ,ＲＡＰＤ片段的克隆是ＲＡＰＤ标记转化中最重要的一步。目前 ,如何快速、高效地克隆ＲＡＰＤ片段的方法研究还没有见到报导 ,为此 ,我们进行了克隆ＲＡＰＤ片段方法的系统比较研究。1　材料与方法1 1　供试材料1 1 1　ＲＡＰＤ标记片段 :ＯＰＮ14 1.3和ＯＰＦ7 1.6是两个与小麦Ｔ型不育恢复系的恢复基因紧密连锁的显性标记 ,该标记是作者在完成其博士论文中筛选到的标记[7] 。1 1 2　克隆载体和菌株 :Ｆｘｘ/ＴＡ载粒由北京市肿瘤研究所生化室提供 ,ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ由中国农业科学院生物技术研究中心提供 ,ｐＵＣ1 9和ＤＨ5α由中国农业科学院作物品种资源研究所重点实验室提供。1 2　克隆方法1 2 1　常规方法 :经典的克隆ＤＮＡ片段的实验方法和详细步骤参看卢圣栋的《现代分子生物学实验技术》。1 2 2　Ｆｘｘ/ＴＡ载粒法 :Ｆｘｘ/ＴＡ载粒为美国科学家构建的一种特殊克隆载体 ,该载体是开环载体 ,大小为 2 76 9ｂｐ ,其两端的 5’端各带有一个Ｔ核苷酸 ,是专门用于对ＰＣＲ产物直接克隆的一种专业载体 ,克隆时ＰＣＲ产物无需通过酶切或修平等酶修饰过程。克隆载体含有ＬａｃＺ基因 ,可用于蓝白斑筛选。克隆位点两侧含有多酶切位点 ,用于鉴定克隆及对ＰＣＲ片段的再克隆 ;多酶切位点两侧设置有Ｔ7、Ｓｐ6启动子 (Ｐｒｏｍｏｔｅｒ) ,可用于体外转录及对ＰＣＲ克隆片隆片段的直接测序。Ｆｘｘ/ＴＡ载粒法克隆ＲＡＰＤ片断流程图见图1。图 1　Ｆｘｘ/ＴＡ载粒法克隆ＲＡＰＤ片段流程示意图Ｆｉｇ .1ＴｈｅｆｌｏｗｃｈａｒｔｏｆｃｌｏｎｉｎｇＲＡＰＤｍａｒｋｅｒｓｂｙＦｘｘ/ＴＡｖｅｃｔｏｒ1 2 3　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ噬粒法克隆ＲＡＰＤ片段 :ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＫＳ噬粒是带有一对Ｍ1 3噬菌体ＤＮＡ复制起点 ,该起点以互为相反的方向插入到含有Ｔ3和Ｔ4噬菌体启动子的一个来自ｐＵＣ质粒系列的载体当中 ,构成一类特殊载体即噬粒 ,它即具有ｐＵＣ系列质粒的优点 ,既含有ＬａｃＺ基因、Ａｍｐ抗性基因 ,可用蓝白斑直接选择 ,又具体Ｍ1 3噬菌体启动子 ,因而这些载体可以在体内产生单链ＤＮＡ或在体外产生ＲＮＡ ,这些产物互补于插入到多克隆位点的外源ＤＮＡ的链中的任意一条链 ,可直接用于测序或用Ｍ1 3通用引物进行ＰＣＲ测序。利用该载体 ,进行了边切边连法克隆ＲＡＰＤ片段的比较试验。图 2　边切边连法克隆ＲＡＰＤ片段示意图Ｆｉｇ .2ＴｈｅｄｉａｇｒａｍｏｆｃｌｏｎｉｎｇｔｈｅＲＡＰＤｆｒａｇｍｅｎｔｂｙ“ｄｉｇｅｓｔｉｎｇａｎｄｌｉｇａｓｉｎｇ”表 1　边切边连法反应体系组成试剂名称 ,Ｒｅａｇｅｎｔ体积 ( μｌ)ＶｏｌｕｍｅＨ2 0 18 510×Ｔ4Ｌｉｇａｓｅｂｕｆｆｅｒ 3.5ＤＮＴＰ( 2Ｍｍ/微升 ) 1.0载体ＫＳ +噬粒 1 0ＲＡＰＤ片段 5 0Ｔ4ＤＮＡ聚合酶 ( ( 5Ｕ/微升 ) ) 1 0ＥｃｏＲＶ( 10Ｕ/微升 ) 2 0Ｔ4ＤＮＡ连接酶 3 0总反应体积 35 02　结果与分析2 1　ＲＡＰＤ片段末端特性ＲＡＰＤ片段是通过 1 0个核苷酸的单个随机引物对模板ＤＮＡ的随机扩增的产物 ,这些产物为双链ＤＮＡ ,但由于ＴａｑＤＮＡ聚合酶具有非模板特异性的在ＤＮＡ 3’末端加Ａ的活性 ,所以扩增的双链ＤＮＡ从严格意义上来讲 ,既不是来末端 ,又不是粘性末端 ,而是 3’端带有Ａ的双链ＤＮＡ ,3’端的碱基Ａ是一个不太稳定的碱基 ,如果回收过程中操作剧烈或保存过程中冻融次数较多或保存时间较长 ,则其 3’Ａ容易掉 ,而变成平末端双链ＤＮＡ。本研究在后来的测序分析中发现 ,ＲＡＰＤ片段其 3’端有一个碱基Ａ和 5’端有一个碱基Ｔ ,证明 3’Ａ的确实存在 ,同时表明5’端的碱基Ｔ是后来在克隆过程中补平的。因此 ,新回收的完整的 3’端带碱基Ａ的ＲＡＰＤ片段如下示 :在充分了解ＲＡＰＤ片段的ＤＮＡ结构后 ,对其的克隆才不会走弯路。首先 ,在把ＲＡＰＤ片段从琼脂糖胶上回收时 ,应注意对其 3’碱基Ａ的保护。实验中采用两种方法回收ＲＡＰＤ片段 ,分别为玻璃奶法和ＷｉｚｚａｒｄＴＭ法。从回收效率来 ,玻璃奶法效率较低且回收过程较复杂 ,回收一个片段 ,大约需 30ｍｉｎ ,而Ｗｉｚ ｚａｒｄＴＭ法回收效率较高 ,且过程简单易于操作 ,时间很短 ,大约 1 5ｍｉｎ左右回收一次 ,但费用稍高一点。从回收片段的完整来看 ,ＲＡＰＤ随机引物扩增的带有 3’Ａ末端的双链ＤＮＡ时 ,最好用ＷｉｚｚａｒｄＴＭ 法 ,该法回收的完整片段性较长 ,3’Ａ端不易被破坏 ,易于进行下一步的连接到Ｆｘｘ/ＴＡ载体上。而玻璃奶法回收过程中 ,需要玻璃奶吸附 ,漂洗ＤＮＡ ,吹打ＤＮＡ过程中易于把长片段ＤＮＡ折断 ,易对于回收带有 3’Ａ片段造成掉Ａ现象 ,将来很难接到ＴＡ载体上。其次 ,克隆的载体应用平末端的限制性内切酶如ＥｃｏＲＶ或ＳｍａＩ来切 ,用Ｔ4ＤＮＡ连接酶连接时 ,连接时间要比粘性末端的连接时间要长。2 2　ＲＡＰＤ标记的混合特性ＲＡＰＤ标记中的一条ＥＢ染色的带有可能是一种单一的片段 ,也有可能是几种片段的混合物 ,而且在以琼脂糖胶为分离介质时 ,大多数的ＲＡＰＤ标记中的一条带是几种片段的混合物。产生的原因有二 :(1 )琼脂糖胶的分辨率较低。一般胶浓度在 1 5 %时 ,其有效的分离范围在 2 0 0ｂｐ至 40 0 0ｂｐ。若以每个引物平均扩增出 1 0条带计算 ,则平均两条带间的碱基数差额为 40 0ｂｐ ,因此 ,2 0 0ｂｐ、2 1 0ｂｐ、或 2 2 0ｂｐ、甚至 2 30ｂｐ从凝胶上看到的却是一条带。这是导致ＲＡＰＤ标记是混合物的主要原因。胡志昂等[5 ] 试验表明 ,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (ＰＡＧＥ)和银染的ＲＡＰＤ扩增产物平均为 2 0～ 40条带 ,用ＥＢ染色的ＲＡＰＤ产物少于 1 0条带 ,平均为用ＥＢ染色的一条ＲＡＰＤ条中有 3～ 4条银染的带。这也就是说 ,琼脂糖电泳分离的ＥＢ显示的单荧光带 ,用ＰＡＧＥ和银染可分辨出多个片段。进一步的克隆实验证实了单荧光带的分子量异质性。 (2 )ＤＮＡ在凝胶上电泳 ,影响其泳动速度的因素有ＤＮＡ长度、ＤＮＡ的碱基组成和三维结构、电级缓冲液的ｐＨ值、电压大小和凝胶浓度。研究表明 ,对于ＲＡＰＤ片段来说 ,电极缓冲液的ｐＨ值、电压大小和凝胶浓度都控制于同一水平 ,扩增的ＲＡＰＤ片段都为双链线性ＤＮＡ ,因此 ,ＲＡＰＤ片段的泳动速度仅与ＤＡＮ长度和碱基组成有关 ,进一步研究发现 ,ＤＮＡ的碱基组成对ＲＡＰＤ片段的迁移率影响不明显 ,这也就是说 ,碱基组成不同 ,但长度相同的ＲＡＰＤ片段在胶上为一条带 ,这是导致ＲＡＰＤ标记是混合物的另一主要原因。针对ＲＡＰＤ标记的混合特性 ,在对其进行克隆时 ,重组载体转化受体菌株后 ,应培养多个克隆 ,从长度和碱基组成上进行分析 ,以免把ＲＡＰＤ标记中的某些片段丢失。2 3　Ｆｘｘ/ＴＡ载体的结果以Ｆｘｘ/ＴＡ为载体的重组子转化ＤＨ5α ,培养后涂于含有ＩＰＴＧ和Ｘ -ｇａｌ的选择培养基上 ,培养 1 6ｈ后 ,放于 4℃冰箱中显色 8ｈ后观察其蓝白斑的分布情况。试验共涂 5块培养基 ,结果每块培养基都有白斑 ,但白斑的数量很少 ,5个培养基上白斑数 /蓝斑数的分布分别为 3/1 0 1 ,4/1 5 0 ,1 /98,6 /1 32 ,2 /1 2 2 ,平均每 1 0 0个蓝斑中有 2 6 5白斑。ＴＡ载体从理论上来说 ,特别适合于克隆ＲＡＰＤ扩增的特异带 ,但从试验结果来看 ,却没有得到预期的良好效果。分析其原因主要有二。一是ＴＡ载体上的 5’Ｔ和ＰＣＲ产物上的 3’Ａ都是不稳定的 ,尤其是ＴＡ载体 ,经过长时间的途中运输 ,商家买卖以及过程的多次冻融 ,造成载体上 5’Ｔ的丢失 ;另外 ,特异片段的回收过程中 ,紫外线较长时间的照射 ,回收过程中的吹打 ,以及沉淀—溶解过程都可能造成 3’Ａ的丢失 ,结果造成ＴＡ载体优点的丢失 ;二是Ｔ4ＤＮＡ连接酶对载体的自连 ,自连的机率远远高于连接外源片段的机率 ,两个原因加起来是造成连接失败的原因。2 4　ｐＵＣ1 9和ｐＢｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ对ＲＡＰＤ片段的克隆结果这两种载体从选择培养基蓝白斑显示结果看 ,ｐＵＣ1 9以经典的克隆方法对ＲＡＰＤ片段的克隆结果最好 ,几乎全部为白斑 ,5个培养基上白斑数 /蓝斑数的分布分别为 1 0 2 /1 0 5 ,90 /92 ,1 38/1 40 ,1 2 6 /2 7,1 0 3/1 0 5 ,平均每1 0 0个蓝斑中有 98 2 4白斑。以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ为载体的克隆结果也很好 ,几乎全部为白斑 ,5个培养基上白斑数 /蓝斑数的分布分别为 6 0 /6 1 ,80 /82 ,91 /92 ,1 0 0 /1 0 6 ,1 0 4/1 0 6 ,平均每 1 0 0个蓝斑中有 97 75白斑。两种克隆方法的克隆结果经ｘ2 测验表明 ,两者间差异不显著 ,表明 ,两种方法对ＲＡＰＤ片段的克隆效果一样。3　讨论3 1　边切边连法的优点边切边连法的要旨是边切边连 ,自连 -再切 -再连 ,一直到目的片段全部连入载体上为止。从图 2中可以看出 ,空载体上带有ＥｃｏＲＶ的酶切位点 ,ＥｃｏＲＶ就把闭环载体切开 ,然后连接 ,连接有两种去向 ,一是开环载体重新环化即自连 ,此时载体的ＥｃｏＲＶ酶切位点又恢复 ,ＥｃｏＲＶ酶将其重新切开 ,只有开环载体上有ＲＡＰＤ片段连入后 ,载体的ＥｃｏＲＶ酶切位点被破坏 ,ＥｃｏＲＶ不能再切 ,从理论上来说 ,只要ＥｃｏＲＶ和Ｔ4ＤＮＡＬｉｇａｓｅ加的量足够 ,反应时间足够长的话 ,连接ＲＡＰＤ片段的效率应该是 1 0 0 %。从上述三种方法的比较来看 ,边切边连法比经典方法和Ｆｘｘ/ＴＡ法经济、快速 ,简单、易行 ,可以推广应用于所有ＲＡＰＤ标记的克隆。另外 ,随着分子生物学技术的快速发展显微切割技术应用于已染色体定位的基因 ,通过切割得到的ＤＮＡ片段是平末端的双链ＤＮＡ ,常规的方法是在其两端加以ＰｏｌｙＡ ,载体上加ＰｏｌｙＴ ,然后连接 ,比较繁琐。边切边连法可直接用于显微切割的片段的克隆。3 2　边切边连法的缺点边切边连法也有其自身不足之处 ,其最大缺点是所要克隆的特异片段上不能含有发载体的内切酶位点 ,否则 ,片段也要被切断 ,造成克隆失败 ,所以用该法之前需要检查ＲＡＰＤ片段 ,用切载体的酶去切回收的ＲＡＰＤ片段 ,然后电泳 ,以检查回收的片段是否被切开。在本试验中 ,所用的片段既不含有ＥｃｏＲＶ切点 ,也不含有ＳｍａⅠ切点 ,所以可以用边切边连法进行克隆 ,而且克隆也很成功。另外 ,需要注意的是 ,由于“边切边连法”切与连、再切再连是一个动态 ,所以反应时间应较长 ,通过本试验得出 ,用 2 4ｈ左右比较合适。通过以上三种方法的比较得出 ,边切边接法方法简单 ,连接效率高 ,最后通过这种方法我们一次成功地将ＯＰＮ14 1.3和ＯＰＦ7 1.6 这两个片段分别连接到载体上快速克隆RAPD片段方法的研究@许占友$中国农业科学院作物品种资源研究所!北京,100081 @张爱民$中国农业大学植物遗传育种系!北京,100094 @张树榛$中国农业大学植物遗传育种系!北京,100094 @贾继增$中国农业科学院作物品种资源研究所!北京,100081 @黎裕$中国农业科学院作物品种资源研究所!北京,100081[1]J 萨姆布鲁克 ,等 分子克隆实验指南 (第二版 ) [M ] 北京 :科学出版社 ,1995 [2 ]卢圣栋 ,等 现代分子生物学实验技术 [M] 高等教育出版社 ,1993 [3]李德葆 ,等 重组DNA的原理和方法 [M] 浙江科学技术出版社 ,1993 [4 ]林万明 ,等 PCR技术操作和应用指南 [M] 人民军医出版社 ,1995 [5 ]胡志昂 ,等 检测植物DNA扩增多态性方法的比较和改进 [J] 植物学报 1997,39(2 ) :144 - 148 [6 ]WiliamsJGK ,etal.DNApolymorphismamplifiedbyarbitraryprimersareusefulasgeneticmarkers .Nucleicacidsresearch[J].1990 ,18:6 5 31- 6 5 35 . 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