苹果褪绿叶斑病毒RT-LAMP检测方法的建立

文献类型： 中文期刊

第一作者： 张双纳

作者： 张双纳;李正男;范旭东;张尊平;任芳;胡国君;董雅凤

作者机构：

关键词： 苹果;苹果褪绿叶斑病毒;反转录环介导等温扩增;real-time PCR;病毒检测

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2018 年 09 期

页码： 1706-1716

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】建立一种利用反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术简便、快速检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的方法。【方法】在ACLSV基因组序列的3个保守区域设计3组引物,每组引物包括一对外引物(F3/B3)和一对内引物(FIP/BIP),从3组引物中筛选出一组效果最好的引物。对RT-LAMP反应体系,即Mg~(2+)、d NTPs、Betaine、FIP/BIP、B3/F3浓度进行优化,Mg~(2+)浓度梯度设置为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mmol·L~(-1),d NTPs浓度为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L~(-1),Betaine浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L~(-1),FIP/BIP浓度为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4μmol·L~(-1),F3/B3浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4μmol·L~(-1);优化RT-LAMP反应条件,采用已优化的反应体系,设置65、63、61、59、57℃5个不同的反应温度,反应时间设定为90 min。在引物筛选和反应体系反应条件优化过程中,使用荧光定量PCR仪,在反应体系中加入荧光染料,利用荧光信号积累实时监测整个反应过程,根据扩增曲线判断反应结果。以携带苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,Ap MV)的植株叶片中提取的总RNA为模板测试RT-LAMP检测方法的特异性。将含ACLSV的叶片总RNA原液进行10倍梯度稀释,以RNA原液和10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)、10~(-6)稀释液作为模板,进行RT-LAMP反应,测试RT-LAMP检测方法的灵敏性。随机采集23株苹果树的叶片,同时进行RT-LAMP和RT-PCR检测,加入SYBR GreenⅠ进行可视化检测。【结果】建立了ACLSV RT-LAMP检测方法,优化的检测体系为:6.0 mmol·L~(-1) Mg~(2+)、1.2 mmol·L~(-1) d NTPs、0.2 mol·L~(-1) Betaine、1.6μmol·L~(-1) FIP/BIP和0.2μmol·L~(-1) F3/B3引物,最佳反应条件为59℃,60 min。特异性检测中,仅ACLSV检测结果为阳性,对照组均为阴性。灵敏性检测中,RT-LAMP方法最低可检测到10-3 RNA稀释液,灵敏度是RT-PCR方法的100倍。随机采取的23株苹果叶片样品RT-PCR阳性检出率为52.2%,RT-LAMP阳性检出率为65.2%,RT-LAMP的检出率高于RT-PCR。【结论】建立的ACLSV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏性高、成本低等特点,可满足基层、科研部门在田间调查、种苗繁育和海关检疫中快速检测ACLSV。

分类号： S432.41

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