文献类型： 中文期刊

作者： 李丽 ¹ ; 张雪寒 ¹ ; 何孔旺 ¹ ; 姜平 ² ; 赵攀登 ¹ ; 叶青 ¹ ; 栾晓婷 ¹ ; 温立斌 ¹ ; 倪艳秀 ¹ ; 周俊明 ¹ ; 吕立新 ¹ ; 郭容利 ¹ ; 俞正玉 ¹ ; 茅爱华 ¹ ; 李彬 ¹ ; 王小敏 ¹ ;

作者机构： 1.江苏省农业科学院兽医研究所

2.南京农业大学动物医学院

关键词： O157:H7;二重PCR;方法建立;细菌分离;样品检测

期刊名称： 华北农学报

ISSN： 1000-7091

年卷期： 2011 年 26 卷 06 期

页码： 62-69

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。