文献类型： 中文期刊

作者： 郑乾明 ¹ ; 王小柯 ¹ ; 王红林 ¹ ; 周嘉 ¹ ; 解璞 ¹ ; 马玉华 ¹ ;

作者机构： 1.贵州省农业科学院果树科学研究所

关键词： 火龙果;糖转运蛋白;pH指示剂;酵母表达;比色法

期刊名称： 园艺学报

ISSN： 0513-353X

年卷期： 2024 年 51 卷 009 期

页码： 2195-2206

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 针对酵母生长互补方法的缺点，利用pH指示剂指示酵母胞外酸化，建立一种检测候选SWEET(sugars will eventually be exported transporter)基因转运活性的新方法。使用0.006%溴甲酚紫（BCP）作为pH指示剂，获得不同pH值下波长589 nm和432 nm的光吸收值A589和A432，建立pH值与A589/A432比值（R589/432）的相关性函数方程。从火龙果（Hylocereus polyrhizus）果实中分离HpSWEET1a和HpSWEET4a基因，两者编码蛋白序列与拟南芥AtSWEET1和AtSWEET4分别具有66.67%和55.36%的一致性，分别属于SWEETⅠ和Ⅱ类成员。利用酵母糖吸收缺陷株系EBY.VW4000表达HpSWEET1a和HpSWEET4a基因，糖饥饿处理后添加葡萄糖或果糖，HpSWEET1a、HpSWEET4a和AtSWEET1(At1g21460，阳性对照)均促使酵母胞外BCP颜色在3～16h由紫色变为黄色，说明发生明显的胞外酸化。进一步的试验表明HpSWEET1a、HpSWEET4a和AtSWEET1促进酵母胞外pH值在3～16 h下降约1.00，载体对照仅下降约0.10。酵母胞外酸化和pH值的明显下降，证明了HpSWEET1a、HpSWEET4a与AtSWEET1功能类似，均具有葡萄糖和果糖转运活性。使用基于超微量分光光度的比色法检测R589/432值，进一步简化检测步骤和缩短时间。添加葡萄糖后培养0.5 h,HpSWEET1a的R589/432值的下降水平远大于载体对照，证明该方法有效。本研究中建立的方法从耗时、准确性、操作和通量等方面均优于目前常用的酵母生长互补检测，可广泛应用于定位细胞膜的SWEET转运蛋白研究。