文献类型： 中文期刊

作者： 王娜 ¹ ; 苏胜杰 ² ; 白帆 ¹ ; 戴伶俐 ¹ ; 张帆 ¹ ; 宋越 ¹ ; 包凤英 ¹ ; 周璇 ¹ ; 赵世华 ¹ ; 张月梅 ¹ ;

作者机构： 1.内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所

2.内蒙古自治区动物疫病预防控制中心

关键词： 溶血性曼氏杆菌;真核表达载体;白细胞毒素;致病机理

期刊名称： 畜牧与饲料科学

ISSN： 1672-5190

年卷期： 2025 年 46 卷 002 期

页码： 109-116

摘要： [目的]扩增羊源A1和A2血清型溶血性曼氏杆菌白细胞毒素A(leukotoxin A,LktA)基因，构建2个血清型菌株的LktA蛋白真核表达载体。[方法]以A1和A2血清型溶血性曼氏杆菌的基因组DNA为模板，利用设计的特异性引物，采用PCR法扩增LktA基因；利用真核表达载体Morange2-C1分别与扩增获得的A1和A2血清型菌株LktA基因构建A1和A2血清型菌株LktA蛋白的重组真核表达载体；对重组真核表达载体进行双酶切（Eco RⅠ和KpnⅠ）和测序鉴定，将鉴定正确的重组真核表达载体采用脂质体转染法转染至293T细胞。转染48 h后，提取细胞总蛋白，利用Western blotting技术，以Anti-mOrange Monoclonal Antibody为一抗、Goat Anti-Mouse IgG为二抗进行鉴定。同时，利用激光共聚焦显微镜对目的蛋白进行亚细胞定位。[结果]以A1和A2血清型溶血性曼氏杆菌基因组DNA为模板，通过PCR技术成功扩增出2株菌的LktA基因，琼脂糖凝胶电泳结果显示均获得1条约2 862 bp的目的条带，与预期片段大小相符。重组真核表达载体经Eco RⅠ和KpnⅠ双酶切后，经琼脂糖凝胶电泳呈现2条清晰条带，其片段大小与预期目的片段及线性化载体大小相符。对双酶切后的重组质粒进行测序分析，结果表明双酶切产物测序序列与原始设计序列的一致性达100%，证实重组表达载体构建成功。细胞转染及Western blotting鉴定结果显示，A1血清型菌株LktA蛋白真核表达载体Morange2-C1-LktA1及A2血清型菌株LktA蛋白真核表达载体Morange2-C1-LktA2在293T细胞中成功表达，在约130 kDa处观察到特异性目的条带。激光共聚焦显微镜观察结果表明，2株菌株的LktA蛋白均定位在细胞膜上。[结论]成功构建了羊源A1和A2血清型溶血性曼氏杆菌的LktA蛋白真核表达载体，确定了其亚细胞定位，为后续研究LktA与宿主受体相互作用的分子机理提供了参考。