文献类型： 中文期刊

作者： 谢思豪 ¹ ; 勾红潮 ¹ ; 卞志标 ¹ ; 李斌 ¹ ; 蔡汝健 ¹ ; 臧莹安 ¹ ; 李春玲 ¹ ;

作者机构： 1.仲恺农业工程学院;广东省农业科学院动物卫生研究所广东省畜禽疫病防治研究重点实验室农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站;广州市从化区动物卫生监督所

关键词： MLKL基因;CRISPR/Cas9基因编辑技术;敲除;PK-15细胞;猪伪狂犬病病毒(PRV)

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2022 年 05 期

页码： 1934-1941

收录情况： 北大核心

摘要： 【目的】构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like, MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO),研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)复制的影响。【方法】根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平；采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平；采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。