文献类型： 中文期刊

作者： 李晓娇 ¹ ; 朱新宇 ¹ ; 邹娴 ² ; 严霞 ² ; 何燕华 ² ; 罗成龙 ² ;

作者机构： 1.仲恺农业工程学院动物科技学院

2.广东省农业科学院动物科学研究所/畜禽育种国家重点实验室/广东省畜禽育种与营养研究重点实验室

关键词： 稳定表达;慢病毒;CRISPR/Cas9;SSA修复;载体构建;DF-1

期刊名称： 广东农业科学

ISSN： 1004-874X

年卷期： 2023 年 002 期

页码： 125-135

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】筛选稳定表达Cas9蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1），并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统，检测DF-1细胞系中的Cas9核酸酶活性。【方法】将携带Cas9蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染293T细胞包装慢病毒，收集慢病毒Cas9上清液感染DF-1细胞，经抗生素筛选得到稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞，分别用PCR和Western blot验证阳性DF-1细胞表达Cas9蛋白的情况；选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的sgRNA序列，将sgRNA退火产物克隆至pYP152构建sgRNA表达载体，并在sgRNA靶位点两端设计引物扩增OVA基因靶片段，将靶片段克隆至报告载体pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ，以破坏mCherry蛋白的表达，之后再将sgRNA表达载体与SSA报告载体共同转染稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞，最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对mCherry蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到27株稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系，采用PCR扩增稳转细胞基因组，结果显示这些细胞具有Cas9蛋白基因序列，Western blots试验结果显示上述稳转细胞株均表达Cas9蛋白；sgRNA表达载体与mCherry-SSA报告载体共转后，通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中mCherry蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系，可为后续在稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。