文献类型： 中文期刊

作者： 蒙亚琦 ¹ ; 姚旭东 ¹ ; 任秀美奥 ¹ ; 郭延华 ² ; 唐红 ² ; 张译元 ² ; 王立民 ² ; 周平 ¹ ;

作者机构： 1.石河子大学动物科技学院

2.省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院

关键词： 绵羊;成纤维细胞生长因子5;CRISPR/Cas9n;基因敲除

期刊名称： 畜牧与兽医

ISSN： 0529-5130

年卷期： 2022 年 54 卷 001 期

页码： 8-15

收录情况： 北大核心

摘要： 成纤维细胞生长因子5(FGF5)是影响毛囊周期性活动及毛发生长的重要生长因子.本研究利用CRISPR/Cas9n系统靶向编辑绵羊成纤维细胞中FGF5基因.首先利用Gibson Assembly法将U6启动子引导表达单导向RNA(sgRNA)的原件构建至pX461质粒中,获得pX461-U6质粒;再将设计并合成好的1对靶向FGF5基因第3外显子的sgRNA及其互补链,经退火连接形成sgRNA-sg1和sgRNA-sg2双链后,分别克隆至带有Bbs Ⅰ和Bsa Ⅰ黏性末端的pX461-U6质粒.构建好的重组质粒pX461-U6-sg1+sg2经测序鉴定后,以电转染的方式转入绵羊成纤维细胞,72 h后收集细胞进行检测分析.经T7E1酶切检测分析表明,成功获得1对具有靶向效果的sgRNA,PCR扩增的FGF5基因片段经TA克隆后进行测序鉴定,结果sgRNA-sg1+sg2在靶位点的打靶效率为100%;缺失的核苷酸数从10到64个不等;基于预测的3D模型和RT-PCR结果显示,FGF5基因的突变将会影响FGF5蛋白与其受体的结合,导致FGF5蛋白失去其生物学功能.本研究构建了可以在同一载体中同时表达2条sgRNA和Cas9n以及绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,瞬时转染至绵羊成纤维细胞后,成功获得了高效靶向绵羊FGF5基因的sgRNA位点,为精确和高效的靶向基因工程提供了科学依据.