文献类型： 中文期刊

作者： 赵翔玥 ¹ ; 张二芹 ² ; 许倩茹 ³ ; 马凡舒 ³ ; 王雅楠 ⁴ ; 牛香香 ² ; 李雪洋 ² ; 张申立 ² ; 张同旭 ⁵ ; 邓瑞广 ⁶ ; 张以芳 ¹ ; 张改平 ² ;

作者机构： 1. 云南农业大学

2. 河南农业大学

3. 西北农林科技大学

4. 吉林大学

5. 河南南阳市第四职业中等专业学校

6. 河南省农业科学院河南省动物免疫学重点实验室农业部动物免疫学重点开放实验室

关键词： 禽流感病毒;H9N2;HA蛋白;纯合子;水稻胚乳;活性鉴定

期刊名称： 华北农学报

ISSN： 1000-7091

年卷期： 2020 年 35 卷 004 期

页码： 230-238

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白.首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植.利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T0阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T1叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T3植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性.结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-HA成功导入到根癌农杆菌EHA105中;PCR检测到有66株植株的HA基因成功整合到水稻基因组;Dot Blot和Western Blot检测结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达;利用荧光定量PCR方法,107株T1中筛选到31株纯合植株;Western Blot检测结果表明,杂交后的HA蛋白表达量大幅度提高;双抗夹心ELISA结果证实,水稻胚乳表达的HA蛋白的活性高于杆状病毒-昆虫细胞.