文献类型： 中文期刊

作者： 孙新艳 ¹ ; 魏莹 ¹ ; 韩晓玉 ¹ ; 王振跃 ¹ ; 陈琳琳 ¹ ; 燕照玲 ¹ ; 施艳 ¹ ;

作者机构： 1.河南农业大学植物保护学院;河南省农业科学院;河南省果树瓜类生物学重点实验室

关键词： 黄瓜;S期激酶相关蛋白1;原核表达;抗血清

期刊名称： 华北农学报

ISSN： 1000-7091

年卷期： 2017 年 06 期

页码： 73-77

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： S期激酶相关蛋白1(Skp1)是SCF型E3泛素连接酶途径的核心蛋白,在真核生物的细胞周期、转录调控、信号传导等细胞进程中发挥关键作用。为了深入研究Skp1的基因功能,通过反转录PCR扩增黄瓜Skp1基因的全长阅读框,Skp1基因全长阅读框由468个核苷酸组成,共编码155个氨基酸,将其通过酶切连接的方式克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,获得重组载体pETSkp1,PCR验证及克隆测序确定开放阅读框的正确性。将重组质粒pETSkp1转化大肠杆菌BL21菌株,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,经IPTG(1 mmol/L)分别诱导3,6,9 h,Skp1基因在大肠杆菌BL21中均得到高效表达,6,9 h对表达量的影响不明显,因此,可用3 h作为后期诱导表达蛋白的时间。将纯化的蛋白作为抗原,免疫新西兰大耳白兔,采集第5次后血清用ELISA测定效价范围为1∶128000~512 000。提取黄瓜叶片的总蛋白,利用获得的抗血清进一步通过Western Blot检测特异性,结果表明,抗血清在500倍和1 000倍稀释时均能特异性地检测到黄瓜叶片中的Skp1蛋白,条带大小在20 k Da左右,与预期的Skp1蛋白大小一致。