文献类型： 中文期刊

作者： 潘永 ¹ ; 王可人 ² ; 李婷 ¹ ; 杨莉 ¹ ; 李刚 ¹ ; 张亚楠 ³ ; 徐景峨 ¹ ;

作者机构： 1.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所

2.遵义市农业农村局

3.广东省现代农业装备研究所

关键词： 大肠杆菌;耐药基因;TD-PCR;特异性

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2024 年 003 期

页码： 269-277

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为建立一种检测大肠杆菌主要耐药基因（ARG）的通用降落PCR （TD-PCR）方法，本研究参考大肠杆菌标准菌株K12 MG1655 yeeJ基因序列设计合成不同Tm值引物、不同产物长度引物、不同长度引物，并参考Gen Bank中登录的β-内酰胺酶、氨基糖苷类、酰胺醇类、喹诺酮类和黏菌素类部分ARG序列设计合成共29对引物。以大肠杆菌标准菌株K12 MG1655总DNA为模板，采用TD-PCR和普通PCR方法，分别利用不同Tm值引物（P1～P8）、不同产物长度引物（P9～P16）、不同长度的引物（P17～P22）分别扩增yeeJ基因，均用于检测TD-PCR方法的特异性；利用引物P5扩增yeeJ基因，根据目的条带平均亮度值，对TD-PCR方法的扩增产物量分析。不同Tm值引物的扩增结果显示，TD-PCR方法中利用8对不同Tm值引物扩增后均出现目的条带，且均无非特异性条带，而普通PCR方法仅有部分引物扩增后出现目的条带，表明以不同Tm值引物扩增时，TD-PCR方法特异性更强，且适用引物Tm值范围较广。不同产物长度扩增结果显示，TD-PCR方法中利用8对引物扩增后均出现相应目的条带，且无非特异条带，而普通PCR方法虽然均出现目的条带，但部分引物扩增后还出现了非特异性条带，表明以不同产物长度引物扩增时，TD-PCR方法的特异性更强。不同长度的引物扩增结果显示，TD-PCR方法中利用6对不同长度的引物扩增后均出现目的条带，且无非特异条带，而普通PCR方法在52℃退火温度时引物P22出现非特异性扩增，表明TD-PCR方特异性更强。扩增产物量分析结果显示，TD-PCR和普通PCR方法扩增的目的条带平均亮度值均随反应总循环数的增加而上升，但普通PCR方法扩增的产物目的条带平均亮度值始终高于TD-PCR，表明TD-PCR方法的扩增产物量低于普通PCR。以24株临床分离的鹅源大肠杆菌总DNA为模板，采用TD-PCR和普通PCR方法，分别对β-内酰胺酶、氨基糖苷类、酰胺醇类、喹诺酮类和黏菌素类共29种ARG进行检测。结果显示，TD-PCR方法对其中25种ARG的检测结果与普通PCR相同，二者符率为100%；而对另外4种ARG检测结果显示，与普通PCR相比，TD-PCR方法的非特异条带明显减少，且无假阳性。表明TD-PCR在检测ARG方面比普通PCR具有更强的特异性。本研究建立了一种特异性较强的检测大肠杆菌主要ARG的TD-PCR通用方法，为细菌耐药性的研究提供了便捷高效的检测技术手段。