文献类型： 中文期刊

作者： 程晶 ¹ ; 陈沛霖 ² ; 郭禹 ³ ; 崔锦蔷 ³ ; 江波 ¹ ; 周林宜 ¹ ; 刘文晓 ¹ ; 李焕荣 ² ; 李永清 ¹ ;

作者机构： 1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所

2.北京农学院动物科学技术学院

3.河北农业大学

关键词： 牛早幼粒细胞白血病蛋白;原核表达;蛋白纯化;单克隆抗体

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2024 年 51 卷 009 期

页码： 4014-4024

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]牛早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PMIL)是细胞核亚结构PML核体(nuclear bodies,NBs)的骨架蛋白,在抗病毒内源性免疫中发挥重要作用.本研究旨在制备牛PML单克隆抗体,为研究PML NBs结构和功能准备物质材料.[方法]构建表达bPML基因截短体的重组质粒pET-32a-bPML,将重组质粒转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析.将经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,应用ELISA方法鉴定单克隆抗体类/亚类和型,进一步鉴定该单克隆抗体识别的抗原表位;通过检测不同种属来源的细胞检测单克隆抗体的特异性;利用该单克隆抗体对外源转染牛PML的细胞进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测;利用该单克隆抗体建立的IFA检测不同的牛源细胞内源PML定位情况.[结果]牛PML在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量大小为50 ku;以此纯化蛋白为免疫原制备出1株抗牛PML单克隆抗体bPML-2G5,其为IgG1亚类,轻链为Kappa型,识别表位位于牛PML结构域78 EQPRPSTSRA88;Western blotting和IFA分析结果显示,bPML-2G5不仅可特异性识别外源转染的牛PML,而且还能特异性识别牛肾细胞、牛鼻甲骨细胞、牛胚气管细胞的胞核内核体结构中的PML.[结论]本研究成功制备了1株分泌牛PML单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体可用于检测外源性及内源性表达的牛PML.