文献类型： 中文期刊
作者： 郑其升 1 ; 毕志香 2 ; 李梅清 2 ; 侯继波 1 ; 陈溥言 3 ;
作者机构： 1.国家兽用生物制品工程技术研究中心
2.山东省畜牧兽医职业学院
3.南京农业大学
关键词： Cre/LoxP;MVA表达系统;猪繁殖与呼吸综合征病毒;无标记重组病毒
期刊名称： 生物工程学报
ISSN： 1000-3061
年卷期： 2011 年 27 卷 06 期
页码： 104-112
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： 为了构建改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体,利用Cre/LoxP DNA重组系统以及本实验室表达Cre酶的BHK-21细胞系(BHK-Cre),以大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Eco gpt)为筛选标记构建可删除筛选标记的双表达穿梭载体pLR-gpt。将Eco gpt基因以及调控其表达的启动子基因置于2个同向的LoxP位点之间,2个独立的多克隆位点位于2个LoxP位点之外,最终获得的重组病毒可以在BHK-Cre细胞系上删除筛选标记Eco gpt。为了验证系统的有效性,将PRRSV NJ-a株ORF5与ORF6基因分别克隆入pLR-gpt的2个多克隆位点中,构建重组转移载体pLRgpt-ORF5/ORF6。经脂质体介导,将pLRgpt-ORF5/ORF6转染已感染亲本MVA 2 h的BHK-21细胞单层,用药物选择性培养基(MXHAT)在24孔板上进行连续筛选纯化,得到带有筛选标记的重组病毒rMVAgpt-GP5/M。将rMVAgpt-GP5/M感染BHK-Cre,获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-GP5/M,Western blotting与间接免疫荧光证明重组病毒能表达GP5与M蛋白,经PCR和病毒生长曲线鉴定,获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-GP5/M已经完全删除筛选标记gpt。结果表明成功构建了痘苗病毒表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体,并且外源基因的插入不影响亲本病毒的复制与外源基因的表达,具有较好的稳定性。
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