文献类型： 中文期刊

作者： 申雪静 ¹ ; 张二芹 ¹ ; 许倩茹 ¹ ; 刘林科 ¹ ; 万博 ¹ ; 刘运超 ¹ ; 孙亚宁 ¹ ; 赵东 ¹ ; 牛香香 ¹ ; 邓瑞广 ¹ ; 张改平 ¹ ;

作者机构： 1.河南农业大学牧医工程学院;西北农林科技大学动物医学院;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室

关键词： 狂犬病病毒;G基因;转基因水稻;荧光定量;纯合子;拷贝数

期刊名称： 农业生物技术学报

ISSN： 1674-7968

年卷期： 2019 年 02 期

页码： 204-211

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 狂犬病病毒(Rabies virus, RV) G蛋白是唯一能激发机体产生细胞免疫,并诱导产生中和抗体的结构蛋白,也是狂犬病病毒中唯一糖基化的结构蛋白,此外还介导细胞融合、受体结合以及参与病毒的致病等。本研究将优化的狂犬病G基因(GenBank登录号:ABI53869.1)序列插入到中间载体pMP3上,成功构建中间载体pMP3-G,然后将中间载体pMP3-G和植物载体pCAMBIA1300通过双酶切、连接,成功地构建了植物表达载体pCAMBIA1300-G。挑选空白未转基因水稻(Oryza sativa)种子TP309消毒,在愈伤诱导培养基上31℃光照3 d,使其长出愈伤组织,用已经转入狂犬病G基因的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105去侵染愈伤组织,并与愈伤组织共培养3 d,将狂犬病G基因导入水稻愈伤组织中。愈伤组织再经过潮霉素抗性筛选、分化、出芽、生根,获得313株植株,取313株植株的叶片通过十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)法提取叶片基因组DNA,对其进行PCR扩增,经核酸胶进行初步鉴定,有79株为阳性,经过炼苗、种植共获得50株阳性表达植株。分别随机挑选50株阳性植株的种子,切半,标记,将不含胚乳的一半研磨,用提取液提取蛋白后通过抗原检测试纸条和Western blot检测,结果表明,G蛋白在转基因水稻种子中成功表达,且具有良好的反应原性。从50株阳性表达植株中挑选出高表达、反应原性最好的4个株系,将这4个株系T1代中与检测阳性结果相对应的含有胚乳的另一半种子进行组织培养种植,在植株移栽大田前后,再次用CTAB法提取T1代植株叶片基因组DNA,并以水稻的内源基因水稻淀粉分支酶基因(rice starch branching enzyme,RBE4)为内参基因,通过相对荧光定量PCR(relative fluorescence quantitative PCR)方法筛选阳性植株中的纯合植株,通过绝对荧光定量PCR(absolute real-time PCR)计算纯合植株的拷贝数,结果显示,132株植株中35株为纯合植株。纯合植株的拷贝数分别为1、2、3、5、7、11、16。本研究为今后制备新型狂犬病亚单位疫苗奠定基础。