文献类型： 中文期刊
作者： 张齐 1 ; 张星星 2 ; 钟发钢 2 ; 王金泉 1 ; 张小莺 1 ;
作者机构： 1.新疆农业大学动物医学学院
2.新疆农垦科学院/省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室
关键词： C反应蛋白(CRP);单域抗体;噬菌体展示技术;原核表达;生物淘选
期刊名称： 华中农业大学学报
ISSN： 1000-2421
年卷期： 2020 年 39 卷 004 期
页码： 93-98
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： 以CRP为免疫原免疫双峰驼后分离外周血淋巴细胞,提取总RNA后经逆转录制备cDNA,通过巢式PCR实验获得目的基因片段并克隆至噬菌体T7载体臂上,构建原始噬菌体库.随后进行4轮生物淘选,通过Phage-ELISA鉴定淘选后的噬菌体库,Bam HⅠ、Hin dⅢ 双酶切构建了pET-28a与阳性克隆的重组质粒,转化入BL21菌株中进行低温诱导表达.经过His-镍离子亲和层析柱纯化获得单域抗体,然后再用间接ELISA鉴定单域抗体与CRP的反应性.研究结果显示,试验成功构建了库容为1.08×108 cfu的抗CRP单域抗体噬菌体库,基因插入率为96.43%(27/28).生物淘选获得了4株与CRP特异性结合的阳性克隆,4株阳性克隆表达载体构建成功,并在BL21细胞中成功表达单域抗体,分子质量约为22 ku.经ELISA鉴定,4个抗体均显示出高亲和力与特异性,其中V2与V3的抗体效价高达1:3200,证明该抗体能够适用于实际检测方法开发.
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