文献类型： 中文期刊
作者： 梁艳 1 ; Vanvimon Saksamerprome 2 ; Kallaya Sritunyalucksan 2 ; 黄倢 1 ;
作者机构： 1.中国水产科学研究院黄海水产研究所
2.Center
关键词： 斑节对虾;RNA干扰;双链RNA;体内转录;大肠杆菌HT115;kazal型蛋白激酶抑制剂
期刊名称： 水产学报
ISSN： 1000-0615
年卷期： 2010 年 34 卷 07 期
页码： 26-32
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱发的特异性沉默目的基因表达的过程,一种大规模制备双链RNA的方法可以便利RNAi技术的应用。以斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂(KPI)基因为例,详细介绍了一种以体内载体表达大量制备dsRNA(>300nt)的方法。使用商业载体pGEMT和pDRIVE,以2步克隆法构建含有发夹环(hairpin loop)dsRNA表达载体,转化RNA酶Ⅲ缺陷的大肠杆菌HT115(DE3)进行体内转录制备dsRNA。构建的发夹RNA表达载体含有494bp的正向靶序列和403bp的反向互补靶序列,其中正向靶序列多出的91bp即可成为loop环,而无需再次克隆加入。培养30mL的细菌,即可得到1mg纯化的dsRNA,而其成本仅为使用商业化体外转录试剂盒的四分之一。为评估RNAi效果,按照每1克虾体肌肉注射2μg dsRNA的剂量,在dsRNA注射后0,6,12和24h采集血淋巴,RT-PCR检测KPI mRNA的基因转录水平。与对照组GFP-dsRNA和NaCl注射组相比,KPI-dsRNA注射组可以在24h内沉默血淋巴中的KPI基因。结果表明该方法是可大规模制备长的dsRNA的方法。
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