文献类型： 中文期刊

作者： 云涛 ¹ ; 张存 ¹ ; 华炯钢 ¹ ; 余斌 ¹ ; 叶伟成 ¹ ; 陈柳 ¹ ; 倪征 ¹ ;

作者机构： 1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所

关键词： 鸭呼肠孤病毒(DRV);多重一步法RT-PCR;基因型

期刊名称： 农业生物技术学报

ISSN： 1674-7968

年卷期： 2016 年 24 卷 12 期

页码： 1964-1972

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 临床发病鸭(Anas platyrhynchos domestica)群中存在两种基因型鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)的感染。为建立一种能鉴别诊断DRVⅠ型(classical DRV,C-DRV)与Ⅱ型(novel DRV,N-DRV)的一步法RT-PCR检测方法,本研究通过对Gen Bank已公布的现有C-DRV和N-DRV S1和S4基因片段序列进行比对分析,设计合成两对特异性引物,并对引物浓度、退火温度和循环次数等扩增条件进行优化,建立一种能鉴别诊断C-DRV和N-DRV的一步法RT-PCR检测方法。结果表明,一步法RT-PCR最佳的反应体系为:Prime Script 1 Step Enzyme Mix 1μL,2×1 Step Buffer 12.5μL,RNA模板1.5μL,上下游引物(20μmol/L)各1μL,RNase Free d H_2O补足25μL;最佳反应条件:50℃反转录30 min;94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30个循环。该方法可从C-DRV和N-DRV基因组中扩增出大小分别为249和505 bp单一特异性片段,从两种病毒基因组混合物中可同时扩增出两条特异性片段,而对鸭源常见病毒及正常细胞基因组在同等条件下检测均为阴性;该方法具有较高的敏感性,其最低病毒检出量分别为0.47和0.62个半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50);对不同代次、不同时间提取的病毒RNA样品重复检验3次,结果均一致。对浙江省2011~2015年采集的239份疑似临床病料进行检测,C-DRV与N-DRV的阳性率分别为2.5%(6/239)和31.4%(75/239);通过对阳性病料P10和P18扩增序列的测序也证实检测结果的准确性。本研究建立的双重一步法RT-PCR可以有效区分两种基因型DRV,且临床样品检测表明N-DRV是浙江省流行的优势基因型。本研究为鉴别诊断CDRV与N-DRV提供了一个快速、灵敏性高及低成本的实验室诊断方法,该方法的建立可为DRV的分子流行病毒学调查提供有效的技术支持。