文献类型： 中文期刊

作者： 汪小福 ¹ ; 付振芳 ² ; 李玥莹 ² ; 陈笑芸 ² ; 彭城 ² ; 徐晓丽 ² ; 魏巍 ² ; 徐俊锋 ² ;

作者机构： 1.浙江省农业科学院浙江省植物有害生物防控重点实验室

2.浙江省农业科学院浙江省植物有害生物防控重点实验室;沈阳师范大学化学与生命科学学院

关键词： 环介导等温扩增(LAMP);酸性络蓝K(ACBK);金属指示剂;可视化;胭脂碱合成酶基因终止子(TNOS)

期刊名称： 农业生物技术学报

ISSN： 1674-7968

年卷期： 2016 年 24 卷 09 期

页码： 1374-1383

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种快速、灵敏度高和特异性强的等温核酸扩增技术,已被广泛用于各领域。与此同时,高灵敏度也使得扩增时极易出现交叉污染,而利用闭管检测技术能有效降低其污染机率。本研究引入了一种新型的金属指示剂-酸性络蓝K(acid chrome blue K,ACBK),建立了闭管LAMP扩增和检测结果可视化检测技术。首先,本研究分别在LAMP扩增的起始体系中,先后分别测试ACBK与缓冲液、d NTPs、引物和Mg2+等组分反应,确定了含有ACBK的LAMP体系中的颜色变化由Mg2+决定,化学方法也进一步验证了这一结论。随后,对LAMP检测体系中的ACBK指示剂的浓度及Mg2+的浓度进行了选择和优化,最终选定25μL扩增体系中ACBK的检测浓度为:2μL 0.04%ACBK,Mg2+浓度为:6 mmol/L。以胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline synthase gene,TNOS)为靶基因,建立了TNOS-ACBK-LAMP检测体系。建立的体系的检测灵敏度针对转基因水稻的检测限为100拷贝,在分别含有50 ng的水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、油菜(Brassica napus)和玉米(Zea mays)基因组中能检测出0.1%的转基因含量。同时,利用不同转化事件及不同作物的转基因材料验证了其检测特异性,结果表明,构建的TNOS-ACBK-LAMP的检测系统具有很强的检测特异性。最终,将该检测体系成功用于对实际玉米样品转基因成分的检测,检测结果既可以裸眼直接判断也可以借助紫外可见光谱分析。该方法的建立为可以加快转基因成分检测的速度,同时也为等温扩增方法的判断提供了新的思路。