文献类型： 中文期刊

作者： 王小敏 ¹ ; 何孔旺 ¹ ; 张文文 ¹ ; 王东田 ² ; 周忠涛 ¹ ; 张雪寒 ¹ ; 周俊明 ¹ ; 汪伟 ¹ ; 倪艳秀 ¹ ; 温立斌 ¹ ;

作者机构： 1.江苏省农业科学院

2.山东省蓬莱市村里集镇畜牧兽医工作站

关键词： 猪输血传播病毒2型;基因克隆;原核表达

期刊名称： 华北农学报

ISSN： 1000-7091

年卷期： 2013 年 28 卷 05 期

页码： 38-43

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为了克隆猪输血传播病毒2型(TTV2)ORF1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达猪TTV2 ORF1蛋白,并对其表达条件进行优化。利用普通PCR从猪TTV2阳性样本中扩增出TTV2 ORF1基因,利用分子克隆的方法将猪TTV2 ORF1基因克隆到原核表达载体pcoldI上,构建表达载体pcold-ORF1,在大肠杆菌中诱导表达带有6个组氨酸标签的ORF1融合蛋白。并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定了pcold-ORF1重组蛋白表达的最佳表达条件。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白在BL21中高效表达,以包涵体形式表达为主,分子质量约为39 kDa。蛋白表达量随诱导时间增加而有所增加,在15℃时表达量最高,而IPTG浓度对蛋白的表达量没有显著影响。Western Blotting结果表明,重组蛋白与猪TTV2阳性血清特异性反应,具有很好的免疫原性。成功获得TTV2-ORF1基因,构建了原核表达载体并获得高效表达,为TTV的ELISA检测方法的建立提供抗原。且重组蛋白在15℃条件下,加入0.2 mmol/L浓度的IPTG,诱导24 h,表达条件最佳。