文献类型： 中文期刊
作者： 耿超 1 ; 赵红梅 1 ; 周丹娜 1 ; 蔡行 1 ; 王双双 1 ;
作者机构： 1.长江大学动物科学学院;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
关键词： 日本乙型脑炎病毒;NS5rdrp蛋白;真核表达;聚合酶链式反应;BHK21细胞;免疫印迹分析
期刊名称： 黑龙江畜牧兽医
ISSN： 1004-7034
年卷期： 2019 年 15 期
页码： 98-100
收录情况： 北大核心
摘要： 为了探究日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的复制机理和研制以JEV复制复合体为靶标的药物,试验以GenBank中收录的JEV HW1株基因序列为模板,设计针对NS5rdrp的特异性引物,提取JEV RNA,反转录得到cDNA,以其为模板使用PCR方法克隆得到NS5rdrp基因片段;利用T4DNA连接酶构建重组质粒pcDNA3.1-NS5rdrp,并对产物测序;提取去除内毒素的重组质粒,用转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染BHK21细胞,转染24 h后观察结果;最后利用Western-blot技术检测NS5rarp蛋白的表达情况。结果表明:PCR扩增得到大小约为920 bp的NS5rdrp基因片段;测序结果经NCBI上BLAST比对分析,克隆得到的NS5rdrp基因与HW1株的同源性为100%;转染时细胞的最佳密度区间为70%～80%,转染试剂与转染质粒的比例为3∶1;经过Western-blot检测,重组质粒在细胞内正常表达,NS5rdrp蛋白的分子质量约为37 ku。说明试验通过真核表达成功获得NS5rdrp蛋白。
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