文献类型： 中文期刊

作者： 魏海霞 ¹ ; 罗健 ¹ ; 郭延华 ¹ ; 张译元 ¹ ; 王立民 ¹ ; 唐红 ¹ ; 周平 ¹ ;

作者机构： 1.石河子大学动物科技学院;省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院

关键词： 绵羊;肌肉生长抑制素基因(MSTN);CRISPR/Cas9;基因突变

期刊名称： 农业生物技术学报

ISSN： 1674-7968

年卷期： 2018 年 26 卷 08 期

页码： 1440-1448

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长负调控因子,MSTN基因突变可造成MSTN生物学功能缺陷,从而引起动物的双肌性状。本研究旨在筛选靶向绵羊(Ovis aries)MSTN基因的高效单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),并构建可标记表达载体,以提高CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)介导的绵羊MSTN基因突变效率。利用Gibson Assembly法将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列与串联表达原件2A序列插入pX330质粒载体中,构建pX330-EGFP质粒载体,并将设计好的12个sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate法分别连入pX330-EGFP质粒载体,以构建12个不同的pX330-EGFP-sgRNA质粒表达载体;将构建好的pX330-EGFP-sgRNA表达载体以电转染的方法分别转入12组绵羊成纤维细胞,48 h后提取各组部分细胞基因组,利用SURVEROR分析初选获得3个具有靶向效果的细胞群(T2,T9,Q2),其对应转染质粒为pX330-EGFP-sgRNA;之后分别提取3组细胞中的阳性转染细胞基因组,扩增MSTN基因并进行测序分析,得出sgRNA-T2、sgRNA-T9、sgRNA-Q2的打靶效率分别为40%、40%、60%。本研究通过构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pX330-EGFP-sgRNA表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊MSTN基因的sgRNA,并获得准确的编辑效率,为后续其他基因sgRNA的筛选提供了借鉴,并为MSTN基因编辑羊的生产提供科学依据。