文献类型： 中文期刊

作者： 李震 ¹ ; 陈永福 ² ;

作者机构： 1.上海农科院畜牧兽医研究所

2.中国农业大学农业生物技术国家重点实验室

关键词： 牛乳β－酪蛋白;ELISA

期刊名称： 山东农业大学学报

ISSN： 1000-2324

年卷期： 1999 年 30 卷 04 期

页码： 451-452+455

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 体外乳腺细胞培养是整体泌乳研究的有效补充，也在乳腺生物反应器的研究中发挥着重要作用。但乳腺细胞分离培养成功的标志不仅仅是细胞的形态特征及增殖特性，更重要的是细胞的生理功能及分化状态。卜酪蛋白为乳中所特有的蛋白质，其在乳中的含量仅次于ａ一马酪蛋白居第二位，故可用这种蛋白做为乳腺细胞分化功能的指标。（①闷ｐ出ｌｉｎｋａｌ;;ｍｌｎ～ｍｐ）方法是以胡作为标记物或指示剂，进行抗原或抗体的检测。与放射免疫法比较。具有所需仪器设备简单、试剂价廉、无放射性危害等优点。９－＄蛋白的ＥＩＪＳＡ检测国内未见文献报道，国外多用Ｗ一印迹法［’，‘］，但Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交更适于少量样品的定性检测，用于大量检测细胞培养物则显得很不方便，而Ｅ［ＪＳＡ方法一次可以方便地检测几十甚至几百个样品。ＥＬＩＳＡ方法中所用的酶有辣根过氧化物物酶（ＨＨＰ）、碱性磷酸酶、卜半乳糖茶酶等。由于ＩＩＲＰ活性强，价廉且性质稳定，故在ＥＩＪＳＡ中使用最广。本实验采用过碘酸盐改良法以ＨＲＰ标记抗体，建立了用ＥＩＪＳＡ夹心法检测牛卜酪蛋白的方法。豆材料与方法１．ｌ动物３只２月龄２．５－３ｋｇ雄性健康新西兰种兔。１．２试剂牛ｐ一酪蛋白（含量ｏｐ％以上），邻苯二胺（ＯＰＤ）为Ｓｉｐｏ公司产品，ＨＲＰ为处山仰ｐＭａｎｎｈａｉｎ公司产品，福氏佐剂购自中国农业科学院兽药研究所。中范围蛋白分子量标准为ｋ瓜湖公司产品。１．３兔抗个卜酷蛋白血清的制备及效价检取２你一ｍｌ的牛卜酪蛋白６ａｌｌ与６ｍｌ完全福氏佐剂混合，用两注射器相对反复抽送直至混合液完全乳化。给３只兔进行免疫注射，初次免疫选Ｍ后肢脚掌部各注射０．ｓｎｄ，背部４点每点０．ＳＩｎｌ。以后每隔１０ｄ加强免疫１次，加强免疫利用福氏不完全性剂和抗原的乳化物，每只兔每次注射的抗原量大约有４ｍｐ，第一次加强免疫经两后肢大腿肌肉内注射，第二次为皮下多点注射，第三次采用静脉及腹腔注射，第四次以后均采用耳缘静脉注射。在加强免疫期间用琼脂双扩散法检测抗血清效价。当达满意效价时，经兔颈动脉放血，分离血清，分装保存于一２０℃冰箱。１．４兔抗个ｐ一酸蛋白抗体的提取和鉴定采用饱和硫酸按沉淀粗提以．之后利用ＳｅＰｈａｄｅｘＧ－２５脱盐，ＤＥＡＥ纤维素纯化Ｄ］。１．５＄标兔抗牛ｐ一酷蛋白抗体的制备及纯抗体的ＨＲＰ标记采用过碘酸盐改良法［‘］。１．６ＥＩＪＳＡ夹心法检测井ｐ一酪蛋白（１）包被抗体：将兔抗牛ｐ一酪蛋白抗体用包被液稀释后，包被％孔酶标板，ＩＱ：）ｔ’Ｊ．孔，４℃过夜。（２）加标准产一酪蛋白（或样品），１００Ｗ孔，刃℃温育Ｉ．５一地。（３）加酶标抗体，１００ＷｆＬ，Ｐｔ温育互．５、Ｚｈ。（４）加显色液５０ｎｄＬ，室温进光显色２０ｏｈ。（５）加终止液那部Ｌ。（ｓｏ）用酶联免疫检测仪测ｏｎ值（４ｓｏ＿）。２结果与讨论２．ｌ兔抗牛卜酯蛋自抗血清的制备３只兔经免疫注射。均产生了抗月一田蛋白抗体。但其中２号免在加强免疫过程中死亡，可能是由于免疫应急或免疫注射液中微粒阻塞血管引起。１号兔经８次加强免疫产生了效价较高的抗血清，琼脂双扩散法测定效价达ｌ：３２。２．２免抗个具一酪蛋白抗体的制备纯化兔抗牛卜酪蛋白经脱盐和去除杂蛋白得以纯化，提纯Ｉｇｈ的分子量大约为１５（）ＫＩ）图１），抗体在最后稀释液中的浓度为２．１６ｍｇ／ｇｈ。２．３ＢｌｌＳＡｋ心法检测牛ｐ一酪蛋白的条件通过实验确定包被抗体浓度为１０ｎｄａｌｌ，ＨＲＰ标记抗体可采用ｇｕ倍稀释。对产一酪蛋白检测的灵敏度为Ｉ０ｎｐｅ，图２为检测ｐ一酪蛋白的标准曲线。实验发现，检测液中的血清成份对测定的结果影响很大，这可能与免疫家兔时抗原中含其他蛋白成分有关，这些微量的蛋白成分极有可能来自牛血清，在卜酪蛋白提纯过程中不易将这些杂蛋白完全去除。所以在乳腺细胞的诱导液中不易添加胎牛血清，以免影响测定结果。个乳腺细胞培养液中的酪蛋白浓度一般是在图２的测定范围之内的。如牛乳腺细胞系ＭＡＣ－Ｔ表达卜酪蛋白的量可达０．ｌ－０．３ｎｄｌ’ｌｌｒｍ沪］，原代培养乳腺细胞（ｌｏ－ｌ炉细胞）酪蛋白的表达量在０－２５（）ｎｄｌｎ培养液／ｄ［’ｊ。牛乳β-酪蛋自检测的ELISA方法@李震$上海农科院畜牧兽医研究所@陈永福$中国农业大学农业生物技术国家重点实验室!北京１０００９４牛乳β－酪蛋白;;ＥＬＩＳＡ1 Zavizion . B et al Subcloning the MAC-T bovine mammary 3epithclial cell line: morphology, growht properties, and cytogeneticanalysis of clonal cells .J. Dairy Sci, 1995, 78: 515-527 2 Wuynh, H.T, Robitaille, G and Tumer J. D Establishment of bovine mammary pithelial cells (MAC-T): An in vitro model forbovine lactation. Exp. Cell Res,1991, 187: 191-199 3周顺伍等.生物化学实验技术.北京农业大学出版社.1991 4免疫组织化学讲习班讲义.北京农业大学兽医学解剖组胚教研组,1984(未发表材料) 5 Talhouk, R. S, Neiswander, R. L.Schanbacher, F. L, In vitro culture of cryopreserved bovine mamary cells on collagengels, synthesis and lactoferrin. Tissue and cell ,1990, 22(5):583-599