文献类型： 中文期刊

作者： 孙如晶 ¹ ; 董世娟 ² ; 于瑞嵩 ² ; 李震 ² ; 李春华 ² ; 司伏生 ² ; 谢春芳 ² ; 陈冰清 ² ; 张道敬 ¹ ;

作者机构： 1.生物反应器工程国家重点实验室

2.上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海种猪工程技术研究中心

关键词： 猪流行性腹泻病毒;HA标签;靶向RNA重组技术;S1^N结构域

期刊名称： 微生物学通报

ISSN： 0253-2654

年卷期： 2024 年 007 期

页码： 2534-2545

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【背景】猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是严重影响养猪业健康发展的动物传染病，其致病原为猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）。PEDV结构蛋白之一——棘突蛋白（spike protein,S protein）负责病毒的侵染、入胞等过程，该蛋白结构和功能研究是PEDV分子生物学研究的热点。S蛋白分为两个功能域，N端的S1亚单位和C端的S2亚单位，以往研究表明PEDV DR13^att毒株S1^N （19-233 aa）结构域缺失，不影响DR13^att毒株的存活和增殖。【目的】基于靶向RNA重组技术，在PEDV (DR13^att) S1^N结构域分别引入HA标签基因、抗坏血酸过氧化物酶（APEX2）基因，构建重组PEDV，考察S1^N结构域能否被标签（记）蛋白或多肽替换。【方法】利用靶向RNA重组技术的PEDV反向遗传学操作平台，将转移载体p-PEDV-DR13^att的S1^N结构域（1-234 aa）分别替换成HA基因、APEX2基因，进行重组转移载体的构建，再分别将线性化的载体体外转录的RNA转染至m PEDV感染的LR7细胞，然后在Vero细胞上拯救重组PEDV。通过观察细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）、RT-PCR检测、测序、间接免疫荧光分析（immunofluorescence assay,IFA）、Western blotting检测对重组病毒进行验证，最后测定重组病毒滴度并绘制重组病毒生长曲线，探究重组病毒与亲本病毒的生长特性。【结果】构建的重组病毒经过拯救和传代，发现引入HA标签蛋白的重组猪流行性腹泻病毒r PEDV-DR13-S1^N-HA （r PEDV-DSH）在P1代出现细胞病变，引入APEX2蛋白的重组猪流行性腹泻病毒r PEDV-DR13-S1^N-APEX2 （r PEDV-DSA）盲传至P4代，未出现细胞病变。对P4代的r PEDV-DSH、r PEDV-DSA进行RT-PCR检测、测序、间接免疫荧光分析、蛋白质印迹法验证，证实引入HA标签的重组病毒r PEDV-DSH拯救成功，而携带APEX2的重组病毒未能拯救成功。重组病毒r PEDV-DSH生长曲线表明rPEDV-DSH与亲本毒株DR13^att有相似的生长趋势，但病毒增殖水平显著低于亲本毒株。【结论】HA标签替换S1^N （1-234 aa）结构域的重组PEDV rPEDV-DSH成功拯救，为进一步研究S蛋白与宿主细胞的互作机制建立了基础。