文献类型： 中文期刊

作者： 蒙亚琦 ¹ ; 姚旭东 ¹ ; 任秀美奥 ¹ ; 郭延华 ² ; 唐红 ² ; 张译元 ² ; 王立民 ² ; 周平 ¹ ;

作者机构： 1.石河子大学动物科技学院

2.新疆农垦科学院省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室

关键词： 绵羊;成纤维细胞生长因子5（FGF5）;单碱基编辑

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2021 年 010 期

页码： 3533-3544

收录情况： 北大核心

摘要： 研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊（Ovis aries）成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor 5,FGF5）基因第1外显子以引入终止密码子,获得定点编辑类型的绵羊胚胎,为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）寡核苷酸链（sgRNA-T1～sgRNA-T4）,构建4组不同的重组表达载体;将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞,随后用Cruiser^TM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示,sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被Cruiser^TM酶酶切,且测序结果表明都具有靶向效果,编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中,并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率,结果显示,胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max（ng/μL）∶sgRNA（ng/μL）=100∶50,从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示,引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子,通过在成纤维细胞转染表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA（T1、T4）;通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎,成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变,为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。