文献类型： 中文期刊
作者： 毛志福 1 ; 王立民 2 ; 张银国 1 ; 周平 2 ;
作者机构： 1.石河子大学动物科技学院
2.新疆农垦科学院
关键词： 人泛素启动子UbB;Fat-1;表达载体;绵羊成纤维细胞;PUFAs
期刊名称： 畜牧兽医学报
ISSN： 0366-6964
年卷期： 2013 年 44 卷 004 期
页码： 528-534
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： 旨在构建不饱和脂肪酸脱氢酶基因Fat-1表达载体,实现人泛素启动子UbB调控外源基因Fat-1在绵羊细胞内表达.PCR扩增得到UbB序列,秀丽隐杆线虫Fat-1基因密码子根据绵羊对同义密码子使用偏好性优化后,由公司合成获得oFat-1基因序列,以及pcDNA3.1中的GBHpolyA序列共同插入pCMV-DsRed2-1载体的多克隆位点(MCS),得到重组真核表达载体pUbB-oFat-polyA-CMV-DsRed,载体序列经酶切测序鉴定.线性化的表达载体采用脂质体包裹后转染绵羊成纤维细胞,经G418抗性和红色荧光标记筛选得到阳性细胞,并对阳性细胞进行PCR和反转录PCR鉴定,HPLC检测细胞中不饱和脂肪酸的变化.构建的真核表达载体序列正确,Fat-1基因能够在绵羊成纤维细胞基因组中正常表达,促进细胞ω-6PUFAs向ω-3PUFAs转化,ω-3PUFAs占总量的百分比从11.48%增加到24.41%,ω-6PUFAs的百分比从88.52%下降到75.59%,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比值从7.82±0.18下降到3.10±0.03,差异极显著(P<0.01).成功构建了UbB启动子介导的Fat-1真核表达载体,筛选得到表达不饱和脂肪酸脱氢酶的绵羊细胞,为进一步制备转基因克隆绵羊奠定了基础.
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