文献类型： 中文期刊

作者： 马静 ¹ ; 张艳艳 ¹ ; 贾新月 ¹ ; 马勋 ¹ ; 王正荣 ¹ ; 薄新文 ¹ ;

作者机构： 1.石河子大学动物科技学院;新疆农垦科学院畜牧兽医研究所省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室

关键词： 微口膜壳绦虫;DAZ基因;原核表达;多克隆抗体;间接免疫荧光试验

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2023 年 45 卷 002 期

页码： 129-137

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为研究微口膜壳绦虫无精子症(DAZ)基因的生物学功能,本研究利用在线软件对WormBase中微口膜壳绦虫DAZ基因(HmN_000202400)及其编码蛋白进行生物信息学分析,并构建DAZ基因的遗传进化树.结果显示,微口膜壳绦虫DAZ基因cDNA全长1494 bp,编码497个氨基酸,存在保守结构域和完整的开放阅读框,无跨膜区和信号肽,且与缩小膜壳绦虫和微小膜壳绦虫亲缘关系较近.本研究经PCR扩增DAZ基因,构建重组质粒pET-22b-DAZ,经双酶切鉴定正确后经IPTG诱导表达,并采用His-Ni柱亲和层析法纯化,经SDS-PAGE检测结果显示,所表达的重组DAZ蛋白(rDAZ)以包涵体形式存在,分子量约为57 ku,且纯化效果较好.利用rDAZ免疫新西兰大白兔,制备兔rDAZ的多克隆抗体,经间接ELISA检测其效价,并利用western blot检测其反应原性.结果显示,该多克隆抗体效价可达1∶128000,且能够与微口膜壳绦虫的天然总蛋白反应,表明获得了反应原性较好的兔rDAZ的多克隆抗体.为研究DAZ的生物学特性,本研究采用荧光定量PCR(qPCR)分别检测DAZ基因在微口膜壳绦虫成虫、似囊尾蚴及虫卵中的相对转录水平;将微口膜壳绦虫制备石蜡切片观察虫体的各组织结构;利用制备的兔rDAZ多克隆抗体采用间接免疫荧光试验(IFA)检测DAZ蛋白在虫体各组织中的定位.qPCR结果显示,DAZ基因在微口膜壳绦虫成虫、似囊尾蚴及虫卵中均不同程度转录,与其虫卵相比,DAZ基因在似囊尾蚴中的转录水平极显著升高(P<0.01),但在成虫中显著降低(P<0.05);石蜡切片观察结果显示,微口膜壳绦虫生殖系统发达,发育成熟的睾丸、卵巢、卵黄腺、子宫、受精囊等主要分布在成节中,而孕节内的其他生殖器官则逐渐退化,唯有子宫扩大并充满虫卵;IFA结果显示,在微口膜壳绦虫的睾丸中可见特异性绿色荧光,而卵巢、卵黄腺、子宫、受精囊等中则无该绿色荧光.上述结果表明,DAZ基因可能在微口膜壳绦虫生殖细胞的初始发育阶段发挥重要调控作用,微口膜壳绦虫不同节片内生殖器官的发育程度不同,且DAZ主要在微口 膜壳绦虫的睾丸中表达.本研究首次发现微口膜壳绦虫DAZ基因可能与雄性生殖系统的发育调控有关,该结果为进一步探究其调控机制奠定了基础.