通过反向遗传操作技术构建传染性支气管炎病毒nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组毒株

文献类型： 中文期刊

第一作者： 翁文莲

作者： 翁文莲;宫晓倩;高波;方守国;王欢;钱琨;丁铲;廖瑛

作者机构：

关键词： 传染性支气管炎病毒（IBV）;体外连接;感染性cDNA克隆;rIBV;rIBV-nsp15-H238A

期刊名称： 病毒学报

ISSN： 1000-8721

年卷期： 2021 年 006 期

页码： 1376-1384

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）属于γ属冠状病毒,其核酸内切酶nsp15（Non-structural protein 15）的功能尚未得到解析。为探讨nsp15在IBV感染和复制过程中的作用,本研究对nsp15的核酸内切酶活性中心H238进行突变,通过体外连接技术构建重组病毒rIBV-nsp15-H238A,并对病毒滴度、感染复制能力和生长曲线进行鉴定。方法如下:将IBV Beaudette-R毒株的基因组分成5个片段克隆到质粒载体,并在每个片段加上Bsa I或Bsm BI限制性酶切位点。通过质粒载体进行扩增后,通过酶切获得cDNA片段,在体外连接成全长基因组cDNA,转录出全长基因组RNA,跟N的转录本一起电击转染到Vero细胞,拯救出重组病毒rIBV和rIBV-nsp15-H238A。利用空斑试验检测比较rIBV和rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度和空斑大小,鉴定nsp15核酸内切酶活性对IBV感染性的影响。结果显示,rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度为2.7×106PFU/mL,比rIBV的病毒滴度（9.4×106PFU/mL）低3倍还多,且rIBV-nsp15-H238A空斑孔径远小于rIBV,说明rIBV-nsp15-H238A复制和扩散能力远低于rIBV。利用TCID50检测病毒的生长曲线,结果表明在感染后0～24h,rIBV-nsp15-H238A的生长曲线均低于rIBV。由此可见,IBV nsp15H238核酸内切酶活性位点对IBV的感染复制起着重要作用。本研究通过反向遗传操作构建nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组病毒,为研究nsp15的功能提供了一个有力的工具。

分类号： R373

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