绵羊胚胎FGF5基因单碱基突变体系的建立
文献类型: 中文期刊
第一作者: 蒙亚琦
作者: 蒙亚琦;姚旭东;任秀美奥;郭延华;唐红;张译元;王立民;周平
作者机构:
关键词: 绵羊;成纤维细胞生长因子5(FGF5);单碱基编辑
期刊名称: 中国畜牧兽医
ISSN: 1671-7236
年卷期: 2021 年 010 期
页码: 3533-3544
收录情况: 北大核心
摘要: 研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊(Ovis aries)成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor 5,FGF5)基因第1外显子以引入终止密码子,获得定点编辑类型的绵羊胚胎,为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA(single guide RNA,sgRNA)寡核苷酸链(sgRNA-T1~sgRNA-T4),构建4组不同的重组表达载体;将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞,随后用CruiserTM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示,sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被CruiserTM酶酶切,且测序结果表明都具有靶向效果,编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中,并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率,结果显示,胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max(ng/μL)∶sgRNA(ng/μL)=100∶50,从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示,引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子,通过在成纤维细胞转染表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA(T1、T4);通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎,成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变,为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。
分类号: S826
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