文献类型： 中文期刊

作者： 翟云云 ¹ ; 李佳佳 ¹ ; 张爽 ¹ ; 任子昱 ¹ ; 金前跃 ² ; 杜永坤 ¹ ; 万博 ¹ ;

作者机构： 1.河南农业大学动物免疫学国际联合研究中心

2.河南省动物免疫学重点实验室

关键词： 伪狂犬病病毒;凋亡相关斑点样蛋白;先天性免疫;猪肾上皮细胞

期刊名称： 畜牧兽医学报

ISSN：

年卷期： 2021 年 002 期

页码： 478-487

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的基因敲除对猪伪狂犬病病毒（PRV）感染PK-15细胞的影响。以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞（PK-15）ASC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC^-/-细胞感染PRV-GFP病毒的增殖差异;RT-PCR检测PRV-gB及IFN-β、ISG15、IL-1β mRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID₅₀检测子代病毒感染力的滴定。结果表明:两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-ASC^-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC^-/-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC^-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC^-/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-ASC^-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力。本研究成功构建了PK15-ASC^-/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除ASC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖。