文献类型： 中文期刊

作者： 董娇 ¹ ; 陆繁 ¹ ; 方晓敏 ² ; 陈瑜哲 ³ ; 包文斌 ¹ ; 王海飞 ¹ ;

作者机构： 1.扬州大学动物科学与技术学院

2.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所

3.昆山市畜禽屠宰检疫中心

关键词： 猪;KLF4基因;CRISPR/Cas9技术;细胞活性;细胞周期

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN：

年卷期： 2024 年 003 期

页码： 893-902

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）基因敲除的猪小肠上皮细胞，并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs（sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3）,经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接，产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定，并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）。PCR扩增敲除位点附近序列，并通过测序判断sgRNA敲除效率；利用Cruiser^TM Enzyme酶切鉴定阳性细胞克隆，通过TA克隆测序鉴定敲除序列；利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示，sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现，3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除，其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经Cruiser^TM Enzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现，KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明，KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示，敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性（P＜0.01）,并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞，且KLF4基因敲除可抑制细胞活性，并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。