文献类型： 中文期刊

作者： 刘璎慧 ¹ ; 蒋丽 ² ; 雷静 ¹ ; 刘祎 ¹ ; 王顺哲 ¹ ; 杨倩 ¹ ; 孙浩然 ¹ ; 范静 ³ ; 张俊杰 ¹ ;

作者机构： 1.新疆农业大学生命科学学院/新疆极端环境生物生态适应与进化重点实验室

2.中国水产科学研究院

3.福海县海富特种鱼养殖有限责任公司

关键词： 白斑狗鱼;zpax4基因;表达特征;基因敲除;CRISPR/Cas9

期刊名称： 南方农业学报

ISSN： 2095-1191

年卷期： 2025 年 56 卷 006 期

页码： 1715-1728

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]探究ZP基因家族中zpax4基因在白斑狗鱼性腺生长发育中的表达情况,利用CRISPR/Cas9技术建立白斑狗鱼zpax4基因敲除模型,为后续探究其生物学功能提供参考依据.[方法]利用RACE克隆白斑狗鱼zpax4基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件进行zpax4蛋白理化性质、结构特点和系统进化分析;应用实时荧光定量PCR分析zpax4基因在白斑狗鱼126、180和320 d 3个时期8个组织中的相对表达量;设计并筛选合适的sgRNA,通过对受精卵的显微注射,建立白斑狗鱼zpax4基因的CRISPR/Cas9敲除模型,并对获得的F0代敲除嵌合体进行组织切片观察.[结果]白斑狗鱼zpax4基因cDNA全长2771 bp,其中,5'非编码区(5'-UTR)为162 bp,3'非编码区(3'-UTR)为150 bp.zpax4基因编码811个氨基酸残基,蛋白分子式C4117H6364N1092O1209S39,理论分子量为91.752 kD,理论等电点(pI)为5.43,且编码蛋白N端有信号肽序列,靠近C端有ZP结构域,无跨膜结构域,其二级结构由α-螺旋(14.3%)、无规则卷曲(54.5%)和延伸链(31.2%)构成.多序列比对和系统发育树分析显示,白斑狗鱼zpax4蛋白与其他几种鱼类的zpax4蛋白氨基酸序列相似性为54.85%,功能结构域位置相对保守.实时荧光定量PCR检测结果显示,白斑狗鱼zpax4基因在肠道、肌肉、鳃、头肾、肾脏、肝脏和精巢中基本无表达,而在3个时期的卵巢中均呈极显著表达(P<0.01),且卵巢中相对表达量在126、180和320 d 3个时期呈先增后减的变化趋势,180 d相对表达量最高;此外,在320 d雄鱼的脑组织中也有一定量的表达.利用CRISPR/Cas9技术筛选得到合适的sgRNA,并成功建立白斑狗鱼zpax4基因敲除模型,得到多种突变类型个体,缺失碱基数分别为1、4、7和8,均不为3的倍数.对F0代嵌合体鱼苗进行整鱼切片分析,并未发现明显的性腺及其他部位的表型异常.[结论]利用CRISPR/Cas9技术对白斑狗鱼zpax4基因进行敲除,成功构建了敲除模型,获得白斑狗鱼zpax4基因敲除嵌合体,并筛选出更优的sgRNA靶点序列.zpax4基因可能在白斑狗鱼卵巢发育的前中期发挥重要作用.