文献类型： 中文期刊

作者： 王钦 ¹ ; 李建林 ¹ ; 唐永凯 ¹ ; 李红霞 ¹ ; 张磊 ¹ ; 沈泽恩 ¹ ; 俞菊华 ¹ ;

作者机构： 1.南京农业大学无锡渔业学院;中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

关键词： 鲤鱼;GroupⅢ分泌型磷脂酶A_2催化活性区(PBVR);标签蛋白;原核表达;磷脂酶活性特征

期刊名称： 南京农业大学学报

ISSN： 1000-2030

年卷期： 2020 年 02 期

页码： 339-346

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]本文旨在获得可溶的鲤鱼(Cyprinus carpio)groupⅢ分泌型磷脂酶A_2(PLA2g3a1)催化活性区(PLA_2 bee venom like region,PBVR)原核重组蛋白,并测定该蛋白的磷脂酶活性。[方法]分别构建标签蛋白小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier,SUMO)、硫氧还原蛋白(thioredoxin A,TrxA)、N利用物质A(N-utilization substance A,NusA)、麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)与PBVR的重组表达质粒,转化入大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)进行原核表达,比较不同标签蛋白的促溶作用;使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,与BSA蛋白标准品电泳比对确定纯化后蛋白的浓度;采用偶联氧脂合酶法测定PBVR重组蛋白的磷脂酶活性。[结果]促溶作用最高的标签蛋白是NusA,可溶性重组蛋白占总蛋白的95%,其次是MBP和TrxA,分别占87%和47%。综合考量可溶性重组蛋白的得率,选择MBP融合蛋白。重组原核表达蛋白MBP-PBVR的磷脂酶比活力[(13.68±0.12)U·μmol~(-1)]显著高于TrxA-PBVR[(0.94±0.01)U·μmol~(-1)]和NusA-PBVR[(0.93±0.04)U·μmol~(-1)](P<0.05)。MBP-PBVR酶促反应最适pH值为7.5,在鲤鱼适宜生长温度(20～30℃)内酶活性无差异,微量Ca~(2+)即能显著提高MBP-PBVR的磷脂酶活性,K_d为0.0153 mmol·L~(-1);MBP-PBVR磷脂酶的米氏方程参数V_m为2.2μmol·L~(-1)·min~(-1),K_m为31.9μmol·L~(-1)。[结论]获得了可溶的具有磷脂酶活性的原核重组表达蛋白PBVR,揭示了MBP-PBVR磷脂酶活性特征。