文献类型： 中文期刊

作者： 明月 ¹ ; 牛银杰 ¹ ; 付小哲 ¹ ; 刘礼辉 ¹ ; 梁红茹 ¹ ; 林强 ¹ ; 李宁求 ¹ ;

作者机构： 1.中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室

关键词： 鳜;AKT2;传染性脾肾坏死病毒;病毒增殖

期刊名称： 西北农林科技大学学报(自然科学版)

ISSN： 1671-9387

年卷期： 2021 年 49 卷 002 期

页码： 14-22

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]研究鳜AKT2(ScAKT2)在传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)增殖中的作用,为鳜ISKNV防控提供参考.[方法]克隆ScAKT2基因开放阅读框,构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化.用纯化后的ScAKT2重组蛋白免疫日本大耳兔后制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体的效价,用间接免疫荧光和Western blot法测定抗体的特异性.克隆鳜AKT2基因,构建过表达载体pCMV-EGFP-ScAKT2,将其转染至CPB细胞系中构建ScAKT2过表达细胞系,用荧光显微镜检测转染效率,用qRT-PCR法及Western blot法分别测定ScAKT2 mRNA水平和蛋白水平的表达,以鉴定ScAKT2过表达细胞系是否构建成功.将ISKNV接种至ScAKT2过表达细胞系中,用qPCR法及Western blot法分别测定ISKNV病毒拷贝数及ISKNV-MCP蛋白的表达,用qRT-PCR 法测定ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA水平的表达情况.[结果]PCR扩增获得1 400 bp的AKT2 ORF片段,成功构建了原核表达质粒,诱导表达出72 ku的重组蛋白.成功制备了ScAKT2多克隆抗体,抗体效价达1 ∶ 256 000,纯化后质量浓度约为10 mg/mL.成功构建了pCMV-EGFP-ScAKT2过表达载体和过表达ScAKT2的CPB细胞系,过表达ScAKT2 CPB细胞可极显著抑制ISKNV的增殖,能明显上调ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA的表达水平.[结论]ScAKT2通过上调先天免疫因子的表达抑制ISKNV的增殖,为鳜ISKNV防控提供了新的潜在靶点.